01

如何提高細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析的準(zhǔn)確性？

姚金龍

貝克曼庫爾特高級應(yīng)用專員

講座簡介：

在各種細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析方法中，臺盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)無疑是細(xì)胞活率分析的金標(biāo)準(zhǔn)。
目前，通過臺盼藍(lán)染色分析細(xì)胞活率的方法包括：傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡+血球計(jì)數(shù)板法，也有市場上很普遍的插片式半自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，以及無需手動(dòng)混勻和染色的全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀。其中，后兩個(gè)分析儀器的出現(xiàn)，不僅很大程度地解放了人力，同時(shí)相比于顯微鏡+血球計(jì)數(shù)板法會更省時(shí)，更合規(guī)，所以被各大制藥企業(yè)所使用。而全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀更是在工藝開發(fā)和生產(chǎn)質(zhì)控方面表現(xiàn)出特有的優(yōu)勢，即減少了人為的樣品吹打混勻和臺盼藍(lán)染色操作誤差，而且每種細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化的測試條件，提高了儀器間數(shù)據(jù)的一致性而廣受歡迎。
但是大家在使用這些儀器一段時(shí)間后，可能會遇到這樣一些問題，譬如：自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的測試結(jié)果為何有時(shí)和血球計(jì)數(shù)板的結(jié)果對不上，我該相信哪一個(gè)？細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測試標(biāo)樣沒有問題，但一檢測細(xì)胞怎么就不行了呢？為何同樣都是CHO細(xì)胞，同事測試結(jié)果是符合預(yù)期的，我的為何就不行呢？
以上問題其實(shí)歸結(jié)一下都是我們測試結(jié)果的準(zhǔn)確性的問題，如何減小測試方法的人為誤差？如何提高我們使用的細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀的測試結(jié)果的準(zhǔn)確性？這些問題都將在此次講座中和大家一起來探討交流。

02

高產(chǎn)穩(wěn)定CHO細(xì)胞株構(gòu)建策略

劉玉梅

上海復(fù)宏漢霖生物醫(yī)藥有限公司高級研究員

講座簡介：

探討影響穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建要素，包括載體，宿主細(xì)胞等。基于平臺優(yōu)化篩選方式，在stable pool基礎(chǔ)上結(jié)合高通量技術(shù)進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞株篩選，分享快速開發(fā)案例，實(shí)現(xiàn)快速、高效、穩(wěn)定細(xì)胞株篩選。

工程細(xì)胞株開發(fā)（Cell Line Development: CLD）的主要目的是通過高通量篩選手段獲得數(shù)個(gè)高產(chǎn)穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，為后續(xù)的工藝開發(fā)及優(yōu)化提供基礎(chǔ)。能否構(gòu)建適合于生產(chǎn)的高表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株，將直接影響后期重組蛋白或單克隆蛋白等藥物的開發(fā)效率和生產(chǎn)成本。

細(xì)胞培養(yǎng)是細(xì)胞株開發(fā)的基礎(chǔ)，無論是細(xì)胞轉(zhuǎn)染、高通量克隆篩選、培養(yǎng)基優(yōu)化、還是抗體表達(dá)，都需要在細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上完成細(xì)胞生長狀態(tài)的檢測，其中包括活細(xì)胞密度（VCD）和活率（Viability）檢測。通過檢測結(jié)果將細(xì)胞密度和活率達(dá)不到要求的細(xì)胞排除掉。最 終，從數(shù)以千計(jì)的克隆細(xì)胞中篩選到穩(wěn)定高產(chǎn)的單克隆細(xì)胞株。

由于要篩選的克隆細(xì)胞量很大，對所培養(yǎng)的細(xì)胞生長狀態(tài)的檢測，通常需要使用高通量分析設(shè)備，有時(shí)甚至結(jié)合移液工作站來完成自動(dòng)化檢測。譬如，使用96孔板檢測細(xì)胞密度和活率，同時(shí)根據(jù)需要可整合自動(dòng)化移液工作站，從而大大提高篩選分析通量，并實(shí)現(xiàn)測試的標(biāo)準(zhǔn)化，減少人為操作誤差，最 終使我們能在有限的平臺基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)細(xì)胞株的篩選。

貝克曼庫爾特生命科學(xué)的Vi-CELL BLU全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀就是這樣一款滿足高通量上樣、全自動(dòng)檢測，并可與自動(dòng)化移液工作站整合的分析儀器。它具有以下一些優(yōu)點(diǎn)滿足細(xì)胞株開發(fā)過程中對克隆細(xì)胞的VCD和Viability準(zhǔn)確和快速地檢測。

96孔板上樣檢測

Vi-CELL BLU全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀除了可以使用24位轉(zhuǎn)盤做不間斷檢測外，同時(shí)可以采用96孔板進(jìn)行高通量樣品分析測試（如下圖所示），使用配套的封板膜可以減少檢測過程中樣品的揮發(fā)，防止待測樣品受到外部環(huán)境的污染，對于有生物安全的細(xì)胞樣品，也可降低對操作人員的危害風(fēng)險(xiǎn)。

Vi-CELL BLU 96孔板檢測照片

和移液工作站整合

為了解決那些重復(fù)操作、通量高、易污染、需要大量人力操作的實(shí)驗(yàn)步驟，如梯度稀釋、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞換液、高通量篩選、克隆挑選等步驟，從而使得上游更通暢，并保證數(shù)據(jù)的完整性，可以使用貝克曼庫爾特Biomek系列自動(dòng)化移液工作站來完成這些工作。

那細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析操作是否也可以整合進(jìn)來，讓自動(dòng)化工作站控制完成相關(guān)檢測呢？答案是可以的。Vi-CELL BLU細(xì)胞計(jì)數(shù)儀可通過OPC UA Server和自動(dòng)化移液工作站實(shí)現(xiàn)有效地整合，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析檢測的自動(dòng)化目的，避免無謂的重復(fù)實(shí)驗(yàn)操作。

Biomek自動(dòng)化移液工作站整合Vi-CELL BLU細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的彩頁

全自動(dòng)和標(biāo)準(zhǔn)化分析

使用96孔板的高通量細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析時(shí)，可以在Cell Type檢測參數(shù)表中設(shè)置染色前的吹打混懸次數(shù)（Aspiration cycles）和染色混合次數(shù)（Mixing cycles），以此讓儀器自動(dòng)對沉降的細(xì)胞吹打均勻。然后，在保證細(xì)胞樣品均一性的前提下，吸取等體積臺盼藍(lán)吹打完成細(xì)胞的均勻染色。最 后，再通過Cell Type中的細(xì)胞識別參數(shù)，對拍攝得到的細(xì)胞進(jìn)行有效地識別分析。檢測結(jié)束后儀器自動(dòng)對管路清洗，接著儀器自動(dòng)對下一個(gè)樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化分析。

Cell Type參數(shù)表

單個(gè)樣品的百圖分析

每個(gè)細(xì)胞樣品按默認(rèn)Cell Type方法檢測可以得到100張細(xì)胞照片，相比于其他細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的拍攝1張、3張或6張照片，同一樣品拍攝100張照片得到的細(xì)胞數(shù)更多，因而該細(xì)胞計(jì)數(shù)方法的系統(tǒng)偏差更小，測試結(jié)果的代表性更好。

CHO細(xì)胞第59張照片（共100張）

同一焦平面下的細(xì)胞直徑檢測

細(xì)胞培養(yǎng)過程中平均直徑的監(jiān)測通常會被忽略，同時(shí)這也是一個(gè)不太容易被細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測準(zhǔn)確的參數(shù)，但這個(gè)直徑參數(shù)有時(shí)影響會很大。

在細(xì)胞轉(zhuǎn)染病毒或質(zhì)粒后，一般細(xì)胞平均直徑會發(fā)生變化。有客戶發(fā)現(xiàn)在Fed-Batch培養(yǎng)過程中細(xì)胞平均直徑有時(shí)會過大，從而可能因?yàn)椴荒褪芘囵B(yǎng)過程中的剪切力，最 終導(dǎo)致Peak-VCD相對其他細(xì)胞更低。

Vi-CELL BLU全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀通過使用聚焦質(zhì)控品完成自動(dòng)對焦（如下圖所示），之后細(xì)胞樣品檢測都在同一焦平面下完成。然后通過檢測L10粒徑質(zhì)控標(biāo)樣的平均粒徑結(jié)果是否在標(biāo)稱值±10%范圍內(nèi)，以此判斷自動(dòng)對焦好壞。同時(shí)，可把L10粒徑質(zhì)控品作為質(zhì)量控制標(biāo)樣，定期監(jiān)測儀器對焦?fàn)顟B(tài)是否正常，以此保證所有的細(xì)胞樣品都是在同一焦平面下檢測，提高細(xì)胞平均直徑檢測的準(zhǔn)確性。

聚焦質(zhì)控品和儀器自動(dòng)對焦示意圖

同一個(gè)CHO細(xì)胞三次測試結(jié)果（考察細(xì)胞密度、活率和直徑的重復(fù)性）

若您希望更多地了解Vi-CELL BLU全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀，請撥打400-821-8935和我們聯(lián)系。

*本產(chǎn)品僅供工業(yè)和科研使用，不用于臨床診斷

前言

當(dāng)我們進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，很多時(shí)候都會對培養(yǎng)或者消化細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行計(jì)算，最常規(guī)的就是細(xì)胞計(jì)數(shù)了。

原始的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法是通過對細(xì)胞進(jìn)行染色，在顯微鏡下人工觀察細(xì)胞狀態(tài)判斷細(xì)胞死活，進(jìn)行計(jì)數(shù)。

顯微觀察是細(xì)胞計(jì)數(shù)的基本原理，但是人工細(xì)胞計(jì)數(shù)是一件非常耗時(shí)耗力的工作，特別是要面對大量樣本的計(jì)數(shù)需求時(shí)，因此就衍生出了細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。

我們常見的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀是這樣的：

圖源：網(wǎng)絡(luò)，侵刪

這些自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的原理又是怎樣的呢？

它們的底層原理是這樣的：

圖源：網(wǎng)絡(luò)，侵刪

其實(shí)自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀就是一個(gè)簡化版的顯微鏡，然后搭載了對圖片進(jìn)行識別的軟件功能，從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的計(jì)數(shù)。

既然自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀可以做到，那么專業(yè)顯微鏡一定可以做得更好。

Echo Rebel和傳統(tǒng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀不同，其具有極高的普適性，無需細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的專用耗材，無論載玻片還是培養(yǎng)皿都可以進(jìn)行計(jì)數(shù)。

Echo Rebel的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀是這樣的：

還可以是這樣的：

與傳統(tǒng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀相比，Echo Rebel細(xì)胞計(jì)數(shù)采用嵌入式設(shè)計(jì)，與顯微鏡融合，細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)間短，普適性高，無需專用耗材，使用和維護(hù)成本低。

你以為這就結(jié)束了，不，我們還可以這樣：