提到細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)，大家首先想到就是流式細(xì)胞分選，該方法使用熒光抗體標(biāo)記單細(xì)胞懸液，再通過(guò)調(diào)節(jié)合適的電壓、補(bǔ)償?shù)?，可以將目的?xì)胞與非目的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。

由于可以對(duì)多參數(shù)、不同熒光強(qiáng)度的細(xì)胞進(jìn)行鑒定、分類、定量和分離，流式分選技術(shù)在同時(shí)進(jìn)行多標(biāo)記的細(xì)胞分選時(shí)，其地位無(wú)可替代。但是當(dāng)需要快速獲得某種分選后的細(xì)胞時(shí)，流式分選的操作較為復(fù)雜，且花費(fèi)的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞的刺激也比較大。

因此，使用免疫納米磁珠進(jìn)行快速細(xì)胞分選的方法應(yīng)運(yùn)而生，該方法不僅對(duì)細(xì)胞刺激性小、速度快，而且操作簡(jiǎn)單，稍等片刻就可快速獲得目的細(xì)胞。

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同時(shí)，納米級(jí)別磁珠無(wú)需洗脫，分選得到的細(xì)胞可直接應(yīng)用于流式分析、細(xì)胞培養(yǎng)、單細(xì)胞測(cè)序等下游實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果展示

純度

*注：小鼠脾 臟細(xì)胞樣本CD3分選后純度流式檢測(cè)結(jié)果，A為分選后陰性管（流出組分），B為分選后陽(yáng)性管（滯留組分）。

Marker激活情況

注：小鼠脾 臟細(xì)胞樣本CD3分選后激活Marker CD69檢測(cè)結(jié)果，A為分選后Day0檢測(cè)結(jié)果，B為分選后用CD3/CD28單抗激活Day3檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用場(chǎng)景多，助力科學(xué)研究

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小技巧2：

在細(xì)胞制備、培養(yǎng)階段，如果該培養(yǎng)細(xì)胞是貼壁細(xì)胞，需用先用胰酶消化細(xì)胞，然后收集待測(cè)樣品細(xì)胞，離心、洗滌、封閉后標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體即可。

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Tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) 是指浸潤(rùn)腫瘤組織的淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，負(fù)責(zé)識(shí)別和攻擊異常細(xì)胞，包括癌細(xì)胞。

流式細(xì)胞術(shù)對(duì)TILs的分選提供了一個(gè)重要的工具，用于表征、純化和研究浸潤(rùn)腫瘤的免疫細(xì)胞群。它有助于研究人員了解TILs的組成、功能和潛在的治 療相關(guān)性，推動(dòng)我們對(duì)腫瘤與免疫相互作用的理解。

我們使用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)分選TILs主要應(yīng)用場(chǎng)景如下：

01、鑒定和表征：

流式細(xì)胞術(shù)允許我們根據(jù)TILs表面標(biāo)記物的特征來(lái)鑒定和表征不同的亞群。通過(guò)使用針對(duì)CD3、CD4、CD8和其他免疫細(xì)胞標(biāo)記物的特異性抗體來(lái)標(biāo)記細(xì)胞，我們可以區(qū)分和定量TILs中的各種T細(xì)胞亞群。這有助于我們了解腫瘤微環(huán)境中TILs的組成和多樣性。

02、特定TIL亞群的純化：

流式細(xì)胞術(shù)分選使我們能夠分離和純化感興趣的特定TIL亞群。通過(guò)基于表面標(biāo)記物的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選和篩選，我們可以收集純凈的TIL亞群用于進(jìn)一步的下游應(yīng)用。這使研究人員能夠研究特定的TIL亞群，并研究其功能特性或基因表達(dá)譜。

03、功能分析：

分選后的TILs可用于功能性分析，以評(píng)估其免疫活性和功能。例如，可以測(cè)試分選后的TILs的增殖能力、細(xì)胞因子產(chǎn)生、對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性或其他功能性實(shí)驗(yàn)。這些分析提供了有關(guān)TIL亞群功能能力和潛在抗腫瘤免疫反應(yīng)的見(jiàn)解。

04、基因組學(xué)或蛋白質(zhì)組學(xué)分析：

流式細(xì)胞術(shù)分選可以獲得純凈的TIL細(xì)胞群，進(jìn)而進(jìn)行基因組學(xué)或蛋白質(zhì)組學(xué)分析。通過(guò)分析分選TILs的基因表達(dá)或蛋白質(zhì)譜，研究人員可以更深入地了解與TILs在腫瘤免疫中相關(guān)的分子機(jī)制和信號(hào)通路。

然而不同于外周血、脾 臟中的淋巴細(xì)胞，TILs的流式檢測(cè)存在更多的不確定性，需要有效優(yōu)化包括樣本處理、配色方案、上樣條件以及分析方法等實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的各個(gè)方面，才能實(shí)現(xiàn)更為準(zhǔn)確、真實(shí)的多色復(fù)雜樣本流式檢測(cè)。

圖1為外周血來(lái)源樣本淋巴細(xì)胞分型的流式檢測(cè)數(shù)據(jù)，由圖可見(jiàn)，淋巴細(xì)胞群體T、B細(xì)胞分群明顯，T細(xì)胞亞群也可清晰區(qū)分。另外，我們也可以看到，該數(shù)據(jù)以FSC通道設(shè)定閾值，其閾值設(shè)定值較低，導(dǎo)致碎片及噪音信號(hào)干擾明顯，不過(guò)由于血液樣本碎片較少，與細(xì)胞分群明顯，故而對(duì)最 終結(jié)果的影響并不大。

圖1 血液樣本淋巴細(xì)胞免疫分型流式數(shù)據(jù)

然而，當(dāng)我們使用同樣的模板檢測(cè)腫瘤組織樣本時(shí)，數(shù)據(jù)就出現(xiàn)了明顯問(wèn)題。實(shí)體瘤組織細(xì)胞構(gòu)成復(fù)雜，并且在將組織樣本制備成單細(xì)胞樣本的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的細(xì)胞碎片，這些雜質(zhì)細(xì)胞及碎片會(huì)對(duì)流式檢測(cè)造成顯著的干擾。如圖2所示，T細(xì)胞中出現(xiàn)了大量CD19和CD3雙陽(yáng)性細(xì)胞，不符合已有文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果。這些雙陽(yáng)性細(xì)胞主要是由于雜質(zhì)細(xì)胞及碎片的非特異干擾導(dǎo)致的。這些干擾對(duì)于流式檢測(cè)及流式分選的準(zhǔn)確性有很大影響，甚至?xí)?dǎo)致得出錯(cuò)誤的結(jié)論。

圖2 浸潤(rùn)腫瘤組織的淋巴細(xì)胞免疫分型流式數(shù)據(jù)

那么，基于以上數(shù)據(jù)，我們應(yīng)該如何優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以提高浸潤(rùn)腫瘤組織的淋巴細(xì)胞分選的準(zhǔn)確性呢？這里給大家以下幾點(diǎn)建議：

01、增加Pan-Marker檢測(cè)：

這里的Pan-Marker是指目標(biāo)細(xì)胞群均表達(dá)，但其他細(xì)胞群體及碎片不表達(dá)的表面標(biāo)記。CD45廣泛表達(dá)于免疫系統(tǒng)的各個(gè)細(xì)胞亞群上，但在非免疫細(xì)胞上沒(méi)有表達(dá)或表達(dá)很低。因此，在檢測(cè)淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞時(shí)，可通過(guò)檢測(cè)CD45是否表達(dá)來(lái)區(qū)分免疫細(xì)胞及非免疫細(xì)胞，以達(dá)到排除雜質(zhì)細(xì)胞干擾的目的。

02、優(yōu)化樣本制備方案：

對(duì)復(fù)雜樣本來(lái)講，樣本制備方案是否合適決定了流式實(shí)驗(yàn)的成功率?？筛鶕?jù)文獻(xiàn)報(bào)道并通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)選擇最 佳的消化酶配方和消化時(shí)間，在確保細(xì)胞得率的同時(shí)盡量減少雜質(zhì)干擾并最 大限度的保存細(xì)胞活性及功能。此外，選擇合適的細(xì)胞分離手段進(jìn)行目的細(xì)胞的富集。例如，若針對(duì)淋巴細(xì)胞檢測(cè)，利用Ficoll或Percoll密度梯度離心法富集單個(gè)核細(xì)胞，可有效去除脂肪、碎片及雜質(zhì)細(xì)胞的干擾。

03、進(jìn)行Fc封閉：

組織浸潤(rùn)的多種細(xì)胞，特別是單核/巨噬細(xì)胞以及DC細(xì)胞高表達(dá)抗體Fc端的受體。這些細(xì)胞在進(jìn)行流式抗體標(biāo)記時(shí)，即使不表達(dá)相關(guān)抗原，也可通過(guò)Fc受體非特異性的結(jié)合流式抗體的Fc端，從而導(dǎo)致非特異信號(hào)。要解決這一問(wèn)題，可購(gòu)買商業(yè)化Fc封閉試劑，在標(biāo)記流式抗體前進(jìn)行Fc封閉即可。

04、合理設(shè)定閾值：

閾值的設(shè)定與實(shí)驗(yàn)?zāi)康南⑾⑾嚓P(guān)。在流式分析實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)當(dāng)設(shè)定閾值去除絕大部分噪音及碎片信號(hào)，僅保留少量碎片信號(hào)即可。在流式分選實(shí)驗(yàn)中，若分選所得細(xì)胞用于培養(yǎng)，同樣應(yīng)當(dāng)設(shè)定閾值去除絕大部分噪音及碎片信號(hào)，僅保留少量碎片信號(hào)，這樣做可以有效提高分選效率及回收率；但若分選所得細(xì)胞用于qPCR、測(cè)序，特別是單細(xì)胞測(cè)序等基因組學(xué)應(yīng)用，由于碎片中含有一定量的核酸片段乃至細(xì)胞核碎片，在分選過(guò)程中就需要將盡可能多的碎片與目的細(xì)胞區(qū)分，因此應(yīng)當(dāng)設(shè)定較低的閾值以暴露足量的碎片信號(hào)讓分選儀器檢測(cè)到，進(jìn)而有效確保分選所得目的細(xì)胞不摻雜核酸碎片，以免影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。

05、利用空白熒光通道排除非特異：

什么是空白熒光通道呢?舉一個(gè)例子，我們?cè)O(shè)計(jì)一個(gè)3色實(shí)驗(yàn)標(biāo)記FITC、PE、PE-Cy7三種染料，沒(méi)有標(biāo)記APC，在檢測(cè)時(shí)APC通道就是空白通道，是不應(yīng)該有陽(yáng)性信號(hào)的。復(fù)雜樣本中的部分雜質(zhì)細(xì)胞有較強(qiáng)的非特異熒光信號(hào)，通常這些非特異的熒光信號(hào)在所有的流式熒光通道中均可檢測(cè)到?；谶@一原理，我們可在上樣時(shí)預(yù)留一到兩個(gè)空白熒光通道，樣本中的目的細(xì)胞沒(méi)有標(biāo)記這些空通道的熒光素，在這些通道里面是陰性的，而雜質(zhì)細(xì)胞的非特異信號(hào)在空白通道中通常也是陽(yáng)性的，我們就可以通過(guò)設(shè)門選擇空白通道中的陰性細(xì)胞來(lái)達(dá)到去除非特異信號(hào)的目的。需要注意的是，利用這一方法時(shí)要充分考慮補(bǔ)償?shù)挠绊?，?好選擇與已用通道補(bǔ)償小或無(wú)補(bǔ)償?shù)耐ǖ雷鳛榭瞻淄ǖ馈?/p>

06、增加細(xì)胞死活染料：

死細(xì)胞的非特異性地結(jié)合會(huì)增加假陽(yáng)性。死細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生自發(fā)熒光干擾特定信號(hào)的檢測(cè)。在TILs分選中去除死細(xì)胞?？梢栽黾訑?shù)據(jù)準(zhǔn)確性：死亡的細(xì)胞可能會(huì)釋放細(xì)胞碎片和細(xì)胞內(nèi)成分，這可能會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，引入假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。通過(guò)去除死細(xì)胞，可以提高分選結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。并且為分選后TILs細(xì)胞活力提供保證：分選到活細(xì)胞可以保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的有效性和可靠性。死亡細(xì)胞不具備正常的生物活性和功能，因此分選到活細(xì)胞可以確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚍从痴鎸?shí)的細(xì)胞生物學(xué)狀態(tài)。

圖3 無(wú)死細(xì)胞排除處理的樣本分析比較

圖4 有死細(xì)胞排除處理的樣本分析比較

復(fù)蘇后的PBMC在免疫染色之前不添加（圖 3）或者添加ViaKrome 405可固定活性染料（55℃，10分鐘）（圖 4）。然后，使用Perfix-nc細(xì)胞染色試劑盒（型號(hào) B10825）處理細(xì)胞，并用Granzyme B-FITC、CD19-PE、CD14-ECD、CD79a-PC5.5、CD3-PC7 和 CD45- Krome Orange 進(jìn)行染色。 

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)信息顯示：兩個(gè)不同條件下，門內(nèi)細(xì)胞在上一門級(jí)百分比也不一樣，充分展示了消除死細(xì)胞以后的數(shù)據(jù)效果。

很常見(jiàn)的場(chǎng)景如下：

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，想用流式檢測(cè)表達(dá)GFP細(xì)胞的百分比并且分選，但是不同的設(shè)門方法讓GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比看起來(lái)有差異，究竟下面哪種策略才適合呢？

今天我們主要討論一下FSC和SSC上設(shè)門對(duì)GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比的影響。讓我們一個(gè)一個(gè)設(shè)門，把每種情況具體看一下。

保持FITC通道上的門不變，我們來(lái)看一下在前向和側(cè)向的散點(diǎn)圖上設(shè)門在不同的位置，代表你選擇了什么類型的細(xì)胞。只有P1賦予了藍(lán)色，其他門的顏色去掉，這樣，我們就可以很方便的看出來(lái)細(xì)胞群在不同的圖上所處的位置。

第 一種設(shè)門，除了左下角靠近0的碎片不圈，其他基本都圈上，從第二張SSC-A和SSC-H排粘連的散點(diǎn)圖可以看出來(lái)有單個(gè)細(xì)胞也有粘連細(xì)胞，P2門下 GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比為61.36%。

第二種設(shè)門，只圈最密集的這一群，從第二張SSC-A和SSC-H排粘連的散點(diǎn)圖可以看出來(lái)，這部分的細(xì)胞基本都是單個(gè)的，P2門下 GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比為65.39%，較第 一種高。

第三種設(shè)門，密集細(xì)胞群左邊的和左下角靠近0的碎片不圈，只圈右邊的這兩群，從第二張SSC-A和SSC-H排粘連的散點(diǎn)圖可以看出來(lái)有單個(gè)細(xì)胞也有粘連細(xì)胞，P2門下 GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比為65.70%，較第 一種高，和第二種差不多，但是稍微高一點(diǎn)。

這樣分析下來(lái)，大家最 大的困惑是這三群細(xì)胞要不要圈，怎么圈才是最 好的？讓我們?cè)诘?一張F(tuán)SC和SSC的散點(diǎn)圖上根據(jù)細(xì)胞群設(shè)三個(gè)門。

三個(gè)門分別為P1、P4和P5，顯示了三種不同的細(xì)胞群。

P1顯示為單個(gè)細(xì)胞，F(xiàn)ITC通道上陽(yáng)性細(xì)胞比例為65.54%。

P4顯示大部分為粘連的細(xì)胞，因此在FITC通道上的陽(yáng)性細(xì)胞比例為71.43%，較P1細(xì)胞群高，如果分析時(shí)加入這群細(xì)胞會(huì)增加GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比。如果在單克隆分選中選擇這群，會(huì)導(dǎo)致雖然篩選到陽(yáng)性細(xì)胞，但是單克隆源性降低。

P5顯示為單個(gè)細(xì)胞，但是因?yàn)镕SC較P1小，考慮是細(xì)胞狀態(tài)不好細(xì)胞呈現(xiàn)皺縮導(dǎo)致，所以其在FITC通道上的陽(yáng)性細(xì)胞比例為20.15%，較P1細(xì)胞群低的多，如果分析時(shí)加入這群細(xì)胞則會(huì)降低GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比。如果加入7AAD染料，這群會(huì)呈現(xiàn)出陽(yáng)性，所以在分選中這群細(xì)胞不該圈選，或者在去除死細(xì)胞的門中去除。

由此可見(jiàn)，如果只想要分析狀態(tài)好的單個(gè)細(xì)胞的GFP陽(yáng)性百分比，那你可以選擇P1門的設(shè)門方式，當(dāng)然也可以把P1和P4都選上，再用SSC-A和SSC-H去掉粘連細(xì)胞對(duì)數(shù)據(jù)的干擾。

練習(xí)題

如果您在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，流式檢測(cè)表達(dá)mCherry細(xì)胞的百分比時(shí)發(fā)現(xiàn)，mCherry通道細(xì)胞群并沒(méi)有呈現(xiàn)明顯分開(kāi)的兩群（由于細(xì)胞在mCherry通道有較高的自發(fā)熒光），要怎么確定mCherry細(xì)胞百分比并且分選呢？

基因工程細(xì)胞的同質(zhì)性對(duì)于很多應(yīng)用都是必要條件，例如細(xì)胞株開(kāi)發(fā)、基因ZL、組織工程以及細(xì)胞ZL與再生醫(yī)學(xué)。CRISPR/Cas9基因編輯存在脫靶等情況，無(wú)法直接得到均質(zhì)的細(xì)胞，因此需要開(kāi)展單細(xì)胞克隆，之后才能用于臨床。

CloneSelect單細(xì)胞分離系統(tǒng)（CloneSelect Single Cell Printer）采用類似噴墨打印的技術(shù)，柔和地產(chǎn)生包裹細(xì)胞的液滴無(wú)接觸地直接分配到微孔板中（圖1）。同時(shí)，該系統(tǒng)借助智能圖像分析，確認(rèn)細(xì)胞數(shù)目，分析細(xì)胞的形態(tài)（大小和圓度）及熒光強(qiáng)度，聯(lián)動(dòng)的真空裝置將不符合要求的液滴（如空液滴或者含多個(gè)細(xì)胞的液滴）直接吸走，而符合要求的細(xì)胞液滴則分配至微孔板，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)細(xì)胞的分選和接種。單細(xì)胞分離系統(tǒng)是一種可比移液器操作的柔和的單細(xì)胞分離技術(shù)，而流式分選由于高的液體剪切力和電壓的影響，會(huì)降低敏感細(xì)胞和部分受損細(xì)胞（如電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞）的成克隆率，因此單細(xì)胞分離系統(tǒng)更適用于基因工程細(xì)胞的克隆，維持細(xì)胞活力，并提供直接的單克隆性圖像證據(jù)。

圖1：CloneSelect f.sight單細(xì)胞分離系統(tǒng)

最近發(fā)表的一篇文章（Characterization of CRISPR/Cas9 RANKL knockout mesenchymal stem cell clones based on single-cell printing technology and emulsion coupling assay as a low-cellularity workflow for single-cell cloning），作者用CRISPR/Cas9對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）開(kāi)展RANKL基因敲除以提高其骨骼形成能力。整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程起始于轉(zhuǎn)染，接著用CloneSelect f.sight單細(xì)胞分離系統(tǒng)開(kāi)展單細(xì)胞克隆，隨后在DNA、RNA以及蛋白質(zhì)水平開(kāi)展分析，ZH開(kāi)展細(xì)胞功能分析（圖2）。

圖2：基因編輯間充質(zhì)干細(xì)胞的單細(xì)胞克隆及分析流程。（圖片來(lái)源：文獻(xiàn)1）。

作者在CRISPR/Cas9基因敲除質(zhì)粒中加入了GFP基因，轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞后，用具備熒光分選功能的CloneSelect f.sight系統(tǒng)分選出轉(zhuǎn)染成功的單細(xì)胞。系統(tǒng)可設(shè)定細(xì)胞直徑、圓度和熒光強(qiáng)度等指標(biāo)，分選出單個(gè)活細(xì)胞并接種至微孔板。圖3為系統(tǒng)分選基因編輯的間充質(zhì)干細(xì)胞的5張連續(xù)的圖像。通過(guò)瀏覽單細(xì)胞分離過(guò)程中記錄的5張連續(xù)的圖像，作者統(tǒng)計(jì)單細(xì)胞接種的成功率為93.9±2.7%（n=451），即僅有~6%的孔為多細(xì)胞孔，或空孔或無(wú)法確認(rèn)（圖4）。這一結(jié)果表明f.sight單細(xì)胞分離系統(tǒng)可以準(zhǔn)確地識(shí)別細(xì)胞并成功將其接種至微孔內(nèi)。

圖3：CloneSelect f.sight系統(tǒng)分選間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)采集的5張連續(xù)圖像，可用于證明單克隆性。（圖片來(lái)源：文獻(xiàn)¹）。

除了帶GFP的基因敲除質(zhì)粒外，作者還將pmaxGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至間充質(zhì)干細(xì)胞作為對(duì)照用于評(píng)估單細(xì)胞分離效率和克隆率。此外，作者轉(zhuǎn)染了多個(gè)不同的基因敲除質(zhì)粒。雖然不同的質(zhì)粒因?yàn)榇笮〔煌尸F(xiàn)各異的轉(zhuǎn)染效率，但是成克隆率都達(dá)到了30%。此外，作者還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的間充質(zhì)干細(xì)胞（31.3±8%）和未轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞（39.6±15.6%）在成克隆率上差異較小，這也表明f.sight的單細(xì)胞分選過(guò)程柔和，因此產(chǎn)生的系統(tǒng)偏差較小（圖4）。

圖4：CloneSelect f.sight單細(xì)胞分離系統(tǒng)的高接種效率（左）和高成克隆率（右）。（圖片來(lái)源：文獻(xiàn)¹）。

接著作者采用surveyor assay、RT-PCR和emulsion coupling分別從DNA、RNA和蛋白質(zhì)水平對(duì)基因編輯后的間充質(zhì)單細(xì)胞開(kāi)展分析。ZH作者選出一株雙等位基因敲除的間充質(zhì)干細(xì)胞（g23d）檢測(cè)其成骨分化的能力，并以未編輯的MSC為對(duì)照開(kāi)展平行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)移到成骨分化培養(yǎng)基后，分別在第7天、14天和21天用茜素紅染色。在第14天，細(xì)胞失去細(xì)長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，開(kāi)始呈現(xiàn)出成骨細(xì)胞樣的形態(tài)，然后在第21天開(kāi)始出現(xiàn)鈣沉積，發(fā)展過(guò)程與親本的MSC對(duì)照類似（圖5）。這表明基因編輯后的MSC其成骨分化能力并沒(méi)有因?yàn)榛蚓庉嫼秃Y選過(guò)程而受到影響。

圖5：RANKL基因敲除的間充質(zhì)干細(xì)胞（g23d）和親本間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)和成骨分化。（圖片來(lái)源：文獻(xiàn)1）。

在這個(gè)研究中，作者搭建了一整套實(shí)驗(yàn)流程，起始于CRISPR/Cas9基因編輯，單細(xì)胞克隆以及DNA、RNA和蛋白質(zhì)各個(gè)水平的分析和細(xì)胞功能測(cè)試。實(shí)驗(yàn)流程中采用CloneSelect f.sight單細(xì)胞分離系統(tǒng)成功GX地分選出基因編輯后帶GFP的間充質(zhì)干細(xì)胞。單細(xì)胞接種效率高達(dá)93.9% (± 2.7%)，且成克隆率高達(dá)31.3% (±8%)。相比傳統(tǒng)的有限稀釋法和流式分選，CloneSelect單細(xì)胞分離系統(tǒng)具有GX率，高活率，操作簡(jiǎn)單，單克隆性證據(jù)充分等優(yōu)勢(shì)，是基因工程細(xì)胞克隆的理想工具。

11月25日，貝克曼庫(kù)爾特第十五屆流式分選全國(guó)用戶會(huì)在合肥成功舉行，100多位專家與學(xué)者相約合肥，共赴每年的約定。

疫情讓大家的距離變遠(yuǎn)了，由于出行限制很多專家未能親臨現(xiàn)場(chǎng)。疫情也讓大家的距離變近了，大家通過(guò)線下與線下結(jié)合的方式，仍然愉快的在學(xué)術(shù)的海洋中暢游。

會(huì)議中讓我們對(duì)腫瘤微環(huán)境與母胎免疫中的機(jī)制有了更深的了解。

而隨著科技的進(jìn)步，納微米醫(yī)藥劑型也在生物藥領(lǐng)域嶄露頭角，而流式細(xì)胞儀的發(fā)展讓小顆粒檢測(cè)獲得了新的方法學(xué)平臺(tái)，更多讓人興奮的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也逐漸增加。

而在細(xì)胞治 療領(lǐng)域，NK細(xì)胞治 療，干細(xì)胞治 療領(lǐng)域，專家進(jìn)行了系統(tǒng)的梳理。也讓大家見(jiàn)證了行業(yè)發(fā)展之快，以及臨床轉(zhuǎn)化研究帶來(lái)的希望。

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希望2023年我們繼續(xù)我們一年一次的約會(huì)。沒(méi)有到現(xiàn)場(chǎng)的朋友可以點(diǎn)擊下面視頻感受來(lái)自現(xiàn)場(chǎng)的熱情。