前言

繼扎那米韋和奧司他韋后的又有一新型流感病毒NA抑 制劑——帕拉米韋，它是一種有機(jī)物，化學(xué)式為C15H28N4O4，是環(huán)戊烷類抗病毒化合物。

作為流感病毒抑 制劑，除了注意安全使用外，更要在意其生產(chǎn)的安全性，為保證其品質(zhì)的的優(yōu)良，需要進(jìn)行一系列的理化檢驗(yàn)檢測(cè)，確定藥品生產(chǎn)中的安全和準(zhǔn)確性，其中旋光就是其檢測(cè)中重要的基礎(chǔ)檢測(cè)環(huán)節(jié)之一。從結(jié)構(gòu)的特性上來初步判斷藥品的正確與否。

本實(shí)驗(yàn)使用海能P850 Pro 全自動(dòng)旋光儀，能夠較好測(cè)定帕拉米韋旋光度。

儀器與試劑

儀器

P850 Pro 全自動(dòng)旋光儀、10cm旋光管、分析天平等。

試劑

純化水

實(shí)驗(yàn)方法

樣品檢測(cè)

準(zhǔn)確稱取500mg樣品放于100mL容量瓶中，加水超聲溶解，并定容至刻度，在20攝氏度下，用旋光儀進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)六次，檢測(cè)其比旋光度。樣品需要現(xiàn)配現(xiàn)用。

結(jié)果與討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示：

結(jié)論

用海能P850 Pro 全自動(dòng)旋光儀測(cè)定帕拉米韋的比旋光度，數(shù)據(jù)重復(fù)性良好，檢測(cè)速度快，可以自動(dòng)完成控溫檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確而穩(wěn)定。

儀器介紹

P 系列全自動(dòng)旋光儀具有全自動(dòng)光電檢測(cè)技術(shù)及更具人性化的人機(jī)對(duì)話操作系統(tǒng)，具有測(cè)量過程精確、可靠及操作便捷等優(yōu)點(diǎn)。

通過對(duì)物質(zhì)旋光度的檢測(cè)，可以分析確定物質(zhì)的濃度、含量及純度等，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、石油、食品、化工、香精、香料、制糖等行業(yè)及相關(guān)的高校和科研院所。

P850 Pro內(nèi)置帕爾貼（Peltier）精確控溫系統(tǒng)、可以滿足用戶在恒定溫度下進(jìn)行測(cè)試的需求；內(nèi)置自動(dòng)校準(zhǔn)程序，并可配置標(biāo)準(zhǔn)管對(duì)儀器進(jìn)行自動(dòng)校準(zhǔn)，滿足用戶在日常操作時(shí)對(duì)儀器測(cè)量精度可控的需求。

提到細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)，大家首先想到就是流式細(xì)胞分選，該方法使用熒光抗體標(biāo)記單細(xì)胞懸液，再通過調(diào)節(jié)合適的電壓、補(bǔ)償?shù)?，可以將目的?xì)胞與非目的細(xì)胞區(qū)分開來。

由于可以對(duì)多參數(shù)、不同熒光強(qiáng)度的細(xì)胞進(jìn)行鑒定、分類、定量和分離，流式分選技術(shù)在同時(shí)進(jìn)行多標(biāo)記的細(xì)胞分選時(shí)，其地位無可替代。但是當(dāng)需要快速獲得某種分選后的細(xì)胞時(shí)，流式分選的操作較為復(fù)雜，且花費(fèi)的時(shí)間過長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞的刺激也比較大。

因此，使用免疫納米磁珠進(jìn)行快速細(xì)胞分選的方法應(yīng)運(yùn)而生，該方法不僅對(duì)細(xì)胞刺激性小、速度快，而且操作簡(jiǎn)單，稍等片刻就可快速獲得目的細(xì)胞。

（▲瑞沃德細(xì)胞分選新品）

新品來襲，自主研發(fā)

瑞沃德細(xì)胞分選產(chǎn)品包括自主研發(fā)的磁珠分選試劑盒和細(xì)胞分選柱，能在短時(shí)間內(nèi)通過簡(jiǎn)單、快速的操作分選得到高純度、高活率的目標(biāo)細(xì)胞。

使用流程

同時(shí)，納米級(jí)別磁珠無需洗脫，分選得到的細(xì)胞可直接應(yīng)用于流式分析、細(xì)胞培養(yǎng)、單細(xì)胞測(cè)序等下游實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果展示

純度

*注：小鼠脾 臟細(xì)胞樣本CD3分選后純度流式檢測(cè)結(jié)果，A為分選后陰性管（流出組分），B為分選后陽性管（滯留組分）。

Marker激活情況

注：小鼠脾 臟細(xì)胞樣本CD3分選后激活Marker CD69檢測(cè)結(jié)果，A為分選后Day0檢測(cè)結(jié)果，B為分選后用CD3/CD28單抗激活Day3檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用場(chǎng)景多，助力科學(xué)研究

免疫學(xué)研究

腫瘤學(xué)研究

神經(jīng)生物學(xué)研究

干細(xì)胞研究

細(xì)胞治療

四大特點(diǎn)，輕松獲取目標(biāo)細(xì)胞

1、可獲得高純度，高活率，高得率的目的細(xì)胞

2、獲得細(xì)胞可直接用于細(xì)胞培養(yǎng)，測(cè)序等下游實(shí)驗(yàn)

3、溫和，低刺激，不改變細(xì)胞原本生物學(xué)特性

4、高效便捷，操作簡(jiǎn)單

新品上市

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小鼠CD3+/ CD4+/ CD8+三種細(xì)胞分選試劑盒

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為期10天的流式分選小技巧征集已經(jīng)結(jié)束啦，大家對(duì)流式分選都有很多心得哦。經(jīng)過5位貝克曼應(yīng)用和市場(chǎng)專家的評(píng)選，有11位小伙伴的作品入圍本輪大眾投票。

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小技巧1：

對(duì)于單克隆的孔板分選，可以適當(dāng)稀釋樣本。放慢進(jìn)樣流速。得到活率更好的單細(xì)胞。對(duì)于細(xì)胞團(tuán)塊：在樣本里加入適當(dāng)?shù)腅DTA和DNAase來防止。對(duì)于極脆弱的細(xì)胞分選：可以讓儀器運(yùn)行時(shí)的進(jìn)樣壓差控制在0.5以內(nèi)。

小技巧2：

在細(xì)胞制備、培養(yǎng)階段，如果該培養(yǎng)細(xì)胞是貼壁細(xì)胞，需用先用胰酶消化細(xì)胞，然后收集待測(cè)樣品細(xì)胞，離心、洗滌、封閉后標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體即可。

還有很多非常實(shí)用的小技巧

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Tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) 是指浸潤(rùn)腫瘤組織的淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，負(fù)責(zé)識(shí)別和攻擊異常細(xì)胞，包括癌細(xì)胞。

流式細(xì)胞術(shù)對(duì)TILs的分選提供了一個(gè)重要的工具，用于表征、純化和研究浸潤(rùn)腫瘤的免疫細(xì)胞群。它有助于研究人員了解TILs的組成、功能和潛在的治 療相關(guān)性，推動(dòng)我們對(duì)腫瘤與免疫相互作用的理解。

我們使用流式細(xì)胞術(shù)來分選TILs主要應(yīng)用場(chǎng)景如下：

01、鑒定和表征：

流式細(xì)胞術(shù)允許我們根據(jù)TILs表面標(biāo)記物的特征來鑒定和表征不同的亞群。通過使用針對(duì)CD3、CD4、CD8和其他免疫細(xì)胞標(biāo)記物的特異性抗體來標(biāo)記細(xì)胞，我們可以區(qū)分和定量TILs中的各種T細(xì)胞亞群。這有助于我們了解腫瘤微環(huán)境中TILs的組成和多樣性。

02、特定TIL亞群的純化：

流式細(xì)胞術(shù)分選使我們能夠分離和純化感興趣的特定TIL亞群。通過基于表面標(biāo)記物的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選和篩選，我們可以收集純凈的TIL亞群用于進(jìn)一步的下游應(yīng)用。這使研究人員能夠研究特定的TIL亞群，并研究其功能特性或基因表達(dá)譜。

03、功能分析：

分選后的TILs可用于功能性分析，以評(píng)估其免疫活性和功能。例如，可以測(cè)試分選后的TILs的增殖能力、細(xì)胞因子產(chǎn)生、對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性或其他功能性實(shí)驗(yàn)。這些分析提供了有關(guān)TIL亞群功能能力和潛在抗腫瘤免疫反應(yīng)的見解。

04、基因組學(xué)或蛋白質(zhì)組學(xué)分析：

流式細(xì)胞術(shù)分選可以獲得純凈的TIL細(xì)胞群，進(jìn)而進(jìn)行基因組學(xué)或蛋白質(zhì)組學(xué)分析。通過分析分選TILs的基因表達(dá)或蛋白質(zhì)譜，研究人員可以更深入地了解與TILs在腫瘤免疫中相關(guān)的分子機(jī)制和信號(hào)通路。

然而不同于外周血、脾 臟中的淋巴細(xì)胞，TILs的流式檢測(cè)存在更多的不確定性，需要有效優(yōu)化包括樣本處理、配色方案、上樣條件以及分析方法等實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的各個(gè)方面，才能實(shí)現(xiàn)更為準(zhǔn)確、真實(shí)的多色復(fù)雜樣本流式檢測(cè)。

圖1為外周血來源樣本淋巴細(xì)胞分型的流式檢測(cè)數(shù)據(jù)，由圖可見，淋巴細(xì)胞群體T、B細(xì)胞分群明顯，T細(xì)胞亞群也可清晰區(qū)分。另外，我們也可以看到，該數(shù)據(jù)以FSC通道設(shè)定閾值，其閾值設(shè)定值較低，導(dǎo)致碎片及噪音信號(hào)干擾明顯，不過由于血液樣本碎片較少，與細(xì)胞分群明顯，故而對(duì)最 終結(jié)果的影響并不大。

圖1 血液樣本淋巴細(xì)胞免疫分型流式數(shù)據(jù)

然而，當(dāng)我們使用同樣的模板檢測(cè)腫瘤組織樣本時(shí)，數(shù)據(jù)就出現(xiàn)了明顯問題。實(shí)體瘤組織細(xì)胞構(gòu)成復(fù)雜，并且在將組織樣本制備成單細(xì)胞樣本的過程中會(huì)產(chǎn)生大量的細(xì)胞碎片，這些雜質(zhì)細(xì)胞及碎片會(huì)對(duì)流式檢測(cè)造成顯著的干擾。如圖2所示，T細(xì)胞中出現(xiàn)了大量CD19和CD3雙陽性細(xì)胞，不符合已有文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果。這些雙陽性細(xì)胞主要是由于雜質(zhì)細(xì)胞及碎片的非特異干擾導(dǎo)致的。這些干擾對(duì)于流式檢測(cè)及流式分選的準(zhǔn)確性有很大影響，甚至?xí)?dǎo)致得出錯(cuò)誤的結(jié)論。

圖2 浸潤(rùn)腫瘤組織的淋巴細(xì)胞免疫分型流式數(shù)據(jù)

那么，基于以上數(shù)據(jù)，我們應(yīng)該如何優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以提高浸潤(rùn)腫瘤組織的淋巴細(xì)胞分選的準(zhǔn)確性呢？這里給大家以下幾點(diǎn)建議：

01、增加Pan-Marker檢測(cè)：

這里的Pan-Marker是指目標(biāo)細(xì)胞群均表達(dá)，但其他細(xì)胞群體及碎片不表達(dá)的表面標(biāo)記。CD45廣泛表達(dá)于免疫系統(tǒng)的各個(gè)細(xì)胞亞群上，但在非免疫細(xì)胞上沒有表達(dá)或表達(dá)很低。因此，在檢測(cè)淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞時(shí)，可通過檢測(cè)CD45是否表達(dá)來區(qū)分免疫細(xì)胞及非免疫細(xì)胞，以達(dá)到排除雜質(zhì)細(xì)胞干擾的目的。

02、優(yōu)化樣本制備方案：

對(duì)復(fù)雜樣本來講，樣本制備方案是否合適決定了流式實(shí)驗(yàn)的成功率。可根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道并通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來選擇最 佳的消化酶配方和消化時(shí)間，在確保細(xì)胞得率的同時(shí)盡量減少雜質(zhì)干擾并最 大限度的保存細(xì)胞活性及功能。此外，選擇合適的細(xì)胞分離手段進(jìn)行目的細(xì)胞的富集。例如，若針對(duì)淋巴細(xì)胞檢測(cè)，利用Ficoll或Percoll密度梯度離心法富集單個(gè)核細(xì)胞，可有效去除脂肪、碎片及雜質(zhì)細(xì)胞的干擾。

03、進(jìn)行Fc封閉：

組織浸潤(rùn)的多種細(xì)胞，特別是單核/巨噬細(xì)胞以及DC細(xì)胞高表達(dá)抗體Fc端的受體。這些細(xì)胞在進(jìn)行流式抗體標(biāo)記時(shí)，即使不表達(dá)相關(guān)抗原，也可通過Fc受體非特異性的結(jié)合流式抗體的Fc端，從而導(dǎo)致非特異信號(hào)。要解決這一問題，可購(gòu)買商業(yè)化Fc封閉試劑，在標(biāo)記流式抗體前進(jìn)行Fc封閉即可。

04、合理設(shè)定閾值：

閾值的設(shè)定與實(shí)驗(yàn)?zāi)康南⑾⑾嚓P(guān)。在流式分析實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)當(dāng)設(shè)定閾值去除絕大部分噪音及碎片信號(hào)，僅保留少量碎片信號(hào)即可。在流式分選實(shí)驗(yàn)中，若分選所得細(xì)胞用于培養(yǎng)，同樣應(yīng)當(dāng)設(shè)定閾值去除絕大部分噪音及碎片信號(hào)，僅保留少量碎片信號(hào)，這樣做可以有效提高分選效率及回收率；但若分選所得細(xì)胞用于qPCR、測(cè)序，特別是單細(xì)胞測(cè)序等基因組學(xué)應(yīng)用，由于碎片中含有一定量的核酸片段乃至細(xì)胞核碎片，在分選過程中就需要將盡可能多的碎片與目的細(xì)胞區(qū)分，因此應(yīng)當(dāng)設(shè)定較低的閾值以暴露足量的碎片信號(hào)讓分選儀器檢測(cè)到，進(jìn)而有效確保分選所得目的細(xì)胞不摻雜核酸碎片，以免影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。

05、利用空白熒光通道排除非特異：

什么是空白熒光通道呢?舉一個(gè)例子，我們?cè)O(shè)計(jì)一個(gè)3色實(shí)驗(yàn)標(biāo)記FITC、PE、PE-Cy7三種染料，沒有標(biāo)記APC，在檢測(cè)時(shí)APC通道就是空白通道，是不應(yīng)該有陽性信號(hào)的。復(fù)雜樣本中的部分雜質(zhì)細(xì)胞有較強(qiáng)的非特異熒光信號(hào)，通常這些非特異的熒光信號(hào)在所有的流式熒光通道中均可檢測(cè)到?；谶@一原理，我們可在上樣時(shí)預(yù)留一到兩個(gè)空白熒光通道，樣本中的目的細(xì)胞沒有標(biāo)記這些空通道的熒光素，在這些通道里面是陰性的，而雜質(zhì)細(xì)胞的非特異信號(hào)在空白通道中通常也是陽性的，我們就可以通過設(shè)門選擇空白通道中的陰性細(xì)胞來達(dá)到去除非特異信號(hào)的目的。需要注意的是，利用這一方法時(shí)要充分考慮補(bǔ)償?shù)挠绊懀?好選擇與已用通道補(bǔ)償小或無補(bǔ)償?shù)耐ǖ雷鳛榭瞻淄ǖ馈?/p>

06、增加細(xì)胞死活染料：

死細(xì)胞的非特異性地結(jié)合會(huì)增加假陽性。死細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生自發(fā)熒光干擾特定信號(hào)的檢測(cè)。在TILs分選中去除死細(xì)胞?？梢栽黾訑?shù)據(jù)準(zhǔn)確性：死亡的細(xì)胞可能會(huì)釋放細(xì)胞碎片和細(xì)胞內(nèi)成分，這可能會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，引入假陽性或假陰性結(jié)果。通過去除死細(xì)胞，可以提高分選結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。并且為分選后TILs細(xì)胞活力提供保證：分選到活細(xì)胞可以保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的有效性和可靠性。死亡細(xì)胞不具備正常的生物活性和功能，因此分選到活細(xì)胞可以確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚍从痴鎸?shí)的細(xì)胞生物學(xué)狀態(tài)。

圖3 無死細(xì)胞排除處理的樣本分析比較

圖4 有死細(xì)胞排除處理的樣本分析比較

復(fù)蘇后的PBMC在免疫染色之前不添加（圖 3）或者添加ViaKrome 405可固定活性染料（55℃，10分鐘）（圖 4）。然后，使用Perfix-nc細(xì)胞染色試劑盒（型號(hào) B10825）處理細(xì)胞，并用Granzyme B-FITC、CD19-PE、CD14-ECD、CD79a-PC5.5、CD3-PC7 和 CD45- Krome Orange 進(jìn)行染色。 

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)信息顯示：兩個(gè)不同條件下，門內(nèi)細(xì)胞在上一門級(jí)百分比也不一樣，充分展示了消除死細(xì)胞以后的數(shù)據(jù)效果。