大家都知道，卡爾費休滴定是一種水分測定的專屬性方法。

但請注意：其前提一定是在沒有副反應發(fā)生的情況下！

Q

什么是副反應？ 

A

樣品中物質(zhì)發(fā)生如下類型的反應：

◆ 干擾卡爾費休反應的化學計量

◆ 改變卡爾費休試劑的pH值

◆ 本身生成或消耗水

◆ 在發(fā)生電極的陽極氧化

◆ 在發(fā)生電極的陰極還原

◆ 與卡爾費休試劑的成分發(fā)生反應

Q

如何識別副反應？ 

A

卡爾費休滴定中存在副反應是比較糟糕的一種情況，更糟糕的是實驗人員沒有及時意識到副反應的存在，從而導致錯誤的實驗結(jié)果。如下是副反應的一些特征跡象。

1. 滴定時間和滴定曲線

副反應的跡象一般有：滴定時間更長（與水標滴定相比）、終點檢測緩慢、滴定結(jié)束后的漂移值高于滴定開始時的漂移值。

比較樣品和水含量相近水標的滴定曲線，即可確認是否存在副反應，如果出現(xiàn)下圖橙色所示穩(wěn)定增加的曲線，則表明存在副反應。

2. 線性度

如發(fā)現(xiàn)測得的水含量取決于樣品質(zhì)量或滴定劑的消耗量，則可繪制水含量與滴定劑消耗量的關(guān)系圖后檢查回歸線的斜率。

理想情況下，斜率 b 應為0，顯著的正值或負值則表明存在副反應。

3. 加標

如果樣品的加標回收率不在100±3%范圍內(nèi)，則表明存在副反應。根據(jù)副反應的類型和速度，回收率可能偏高或偏低。如，含有DMSO（二甲亞砜）的樣品會改變卡爾費休反應的化學計量，從而導致結(jié)果偏低。

不過，即使是100%的回收率也并不能保證沒有副反應存在,因為如果副反應發(fā)生非常迅速，在加標過程開始時副反應已經(jīng)完成，則無法被檢測到。歐洲藥典2.5.12章詳細描述了該加標過程。

4. 初步測試

碘化物（I-）的氧化或碘單質(zhì)（I2）的還原均會導致錯誤的結(jié)果。

一個簡單的測試即可確認樣品是否與碘或碘化物發(fā)生副反應：將樣品溶解在弱酸性醇溶液中，然后加入幾滴碘或碘化鉀溶液。如果顏色發(fā)生變化——碘褪色或生成棕色碘，則表明存在副反應。

5. 評估氧化還原電位

將樣品物質(zhì)的氧化還原電對的氧化還原電位與 I2/I- 的氧化還原電位進行比較，有助于評估是否可能發(fā)生意料之外的氧化還原反應。

如果標準電位高于 I2/I- 的電位（如，Cl2），I-的氧化可能導致結(jié)果偏低；如果標準電位低于I2/I-的電位（如，Pb），I2 的還原可能會導致結(jié)果偏高。

Q  如何避免副反應？

結(jié)論

各種類型的副反應均會對卡爾費休滴定產(chǎn)生干擾，從而導致錯誤的實驗結(jié)果。因此，及時識別并采取適當?shù)拇胧﹣肀苊飧狈磻獙τ趯嶒灲Y(jié)果的準確性至關(guān)重要。

瑞士萬通持續(xù)致力于為您的卡爾費休滴定提供不斷優(yōu)化的解決方案及多層次技術(shù)支撐，請繼續(xù)關(guān)注我們，了解更多精彩內(nèi)容！

Tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) 是指浸潤腫瘤組織的淋巴細胞。淋巴細胞是免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，負責識別和攻擊異常細胞，包括癌細胞。

流式細胞術(shù)對TILs的分選提供了一個重要的工具，用于表征、純化和研究浸潤腫瘤的免疫細胞群。它有助于研究人員了解TILs的組成、功能和潛在的治 療相關(guān)性，推動我們對腫瘤與免疫相互作用的理解。

我們使用流式細胞術(shù)來分選TILs主要應用場景如下：

01、鑒定和表征：

流式細胞術(shù)允許我們根據(jù)TILs表面標記物的特征來鑒定和表征不同的亞群。通過使用針對CD3、CD4、CD8和其他免疫細胞標記物的特異性抗體來標記細胞，我們可以區(qū)分和定量TILs中的各種T細胞亞群。這有助于我們了解腫瘤微環(huán)境中TILs的組成和多樣性。

02、特定TIL亞群的純化：

流式細胞術(shù)分選使我們能夠分離和純化感興趣的特定TIL亞群。通過基于表面標記物的表達，對細胞進行分選和篩選，我們可以收集純凈的TIL亞群用于進一步的下游應用。這使研究人員能夠研究特定的TIL亞群，并研究其功能特性或基因表達譜。

03、功能分析：

分選后的TILs可用于功能性分析，以評估其免疫活性和功能。例如，可以測試分選后的TILs的增殖能力、細胞因子產(chǎn)生、對腫瘤細胞的細胞毒性或其他功能性實驗。這些分析提供了有關(guān)TIL亞群功能能力和潛在抗腫瘤免疫反應的見解。

04、基因組學或蛋白質(zhì)組學分析：

流式細胞術(shù)分選可以獲得純凈的TIL細胞群，進而進行基因組學或蛋白質(zhì)組學分析。通過分析分選TILs的基因表達或蛋白質(zhì)譜，研究人員可以更深入地了解與TILs在腫瘤免疫中相關(guān)的分子機制和信號通路。

然而不同于外周血、脾 臟中的淋巴細胞，TILs的流式檢測存在更多的不確定性，需要有效優(yōu)化包括樣本處理、配色方案、上樣條件以及分析方法等實驗設(shè)計的各個方面，才能實現(xiàn)更為準確、真實的多色復雜樣本流式檢測。

圖1為外周血來源樣本淋巴細胞分型的流式檢測數(shù)據(jù)，由圖可見，淋巴細胞群體T、B細胞分群明顯，T細胞亞群也可清晰區(qū)分。另外，我們也可以看到，該數(shù)據(jù)以FSC通道設(shè)定閾值，其閾值設(shè)定值較低，導致碎片及噪音信號干擾明顯，不過由于血液樣本碎片較少，與細胞分群明顯，故而對最 終結(jié)果的影響并不大。

圖1 血液樣本淋巴細胞免疫分型流式數(shù)據(jù)

然而，當我們使用同樣的模板檢測腫瘤組織樣本時，數(shù)據(jù)就出現(xiàn)了明顯問題。實體瘤組織細胞構(gòu)成復雜，并且在將組織樣本制備成單細胞樣本的過程中會產(chǎn)生大量的細胞碎片，這些雜質(zhì)細胞及碎片會對流式檢測造成顯著的干擾。如圖2所示，T細胞中出現(xiàn)了大量CD19和CD3雙陽性細胞，不符合已有文獻報道的結(jié)果。這些雙陽性細胞主要是由于雜質(zhì)細胞及碎片的非特異干擾導致的。這些干擾對于流式檢測及流式分選的準確性有很大影響，甚至會導致得出錯誤的結(jié)論。

圖2 浸潤腫瘤組織的淋巴細胞免疫分型流式數(shù)據(jù)

那么，基于以上數(shù)據(jù)，我們應該如何優(yōu)化實驗設(shè)計以提高浸潤腫瘤組織的淋巴細胞分選的準確性呢？這里給大家以下幾點建議：

01、增加Pan-Marker檢測：

這里的Pan-Marker是指目標細胞群均表達，但其他細胞群體及碎片不表達的表面標記。CD45廣泛表達于免疫系統(tǒng)的各個細胞亞群上，但在非免疫細胞上沒有表達或表達很低。因此，在檢測淋巴細胞等免疫細胞時，可通過檢測CD45是否表達來區(qū)分免疫細胞及非免疫細胞，以達到排除雜質(zhì)細胞干擾的目的。

02、優(yōu)化樣本制備方案：

對復雜樣本來講，樣本制備方案是否合適決定了流式實驗的成功率?？筛鶕?jù)文獻報道并通過預實驗來選擇最 佳的消化酶配方和消化時間，在確保細胞得率的同時盡量減少雜質(zhì)干擾并最 大限度的保存細胞活性及功能。此外，選擇合適的細胞分離手段進行目的細胞的富集。例如，若針對淋巴細胞檢測，利用Ficoll或Percoll密度梯度離心法富集單個核細胞，可有效去除脂肪、碎片及雜質(zhì)細胞的干擾。

03、進行Fc封閉：

組織浸潤的多種細胞，特別是單核/巨噬細胞以及DC細胞高表達抗體Fc端的受體。這些細胞在進行流式抗體標記時，即使不表達相關(guān)抗原，也可通過Fc受體非特異性的結(jié)合流式抗體的Fc端，從而導致非特異信號。要解決這一問題，可購買商業(yè)化Fc封閉試劑，在標記流式抗體前進行Fc封閉即可。

04、合理設(shè)定閾值：

閾值的設(shè)定與實驗目的息息相關(guān)。在流式分析實驗中，應當設(shè)定閾值去除絕大部分噪音及碎片信號，僅保留少量碎片信號即可。在流式分選實驗中，若分選所得細胞用于培養(yǎng)，同樣應當設(shè)定閾值去除絕大部分噪音及碎片信號，僅保留少量碎片信號，這樣做可以有效提高分選效率及回收率；但若分選所得細胞用于qPCR、測序，特別是單細胞測序等基因組學應用，由于碎片中含有一定量的核酸片段乃至細胞核碎片，在分選過程中就需要將盡可能多的碎片與目的細胞區(qū)分，因此應當設(shè)定較低的閾值以暴露足量的碎片信號讓分選儀器檢測到，進而有效確保分選所得目的細胞不摻雜核酸碎片，以免影響后續(xù)實驗準確性。

05、利用空白熒光通道排除非特異：

什么是空白熒光通道呢?舉一個例子，我們設(shè)計一個3色實驗標記FITC、PE、PE-Cy7三種染料，沒有標記APC，在檢測時APC通道就是空白通道，是不應該有陽性信號的。復雜樣本中的部分雜質(zhì)細胞有較強的非特異熒光信號，通常這些非特異的熒光信號在所有的流式熒光通道中均可檢測到?；谶@一原理，我們可在上樣時預留一到兩個空白熒光通道，樣本中的目的細胞沒有標記這些空通道的熒光素，在這些通道里面是陰性的，而雜質(zhì)細胞的非特異信號在空白通道中通常也是陽性的，我們就可以通過設(shè)門選擇空白通道中的陰性細胞來達到去除非特異信號的目的。需要注意的是，利用這一方法時要充分考慮補償?shù)挠绊?，?好選擇與已用通道補償小或無補償?shù)耐ǖ雷鳛榭瞻淄ǖ馈?/p>

06、增加細胞死活染料：

死細胞的非特異性地結(jié)合會增加假陽性。死細胞會產(chǎn)生自發(fā)熒光干擾特定信號的檢測。在TILs分選中去除死細胞?？梢栽黾訑?shù)據(jù)準確性：死亡的細胞可能會釋放細胞碎片和細胞內(nèi)成分，這可能會干擾實驗結(jié)果，引入假陽性或假陰性結(jié)果。通過去除死細胞，可以提高分選結(jié)果的準確性和可靠性。并且為分選后TILs細胞活力提供保證：分選到活細胞可以保證后續(xù)實驗的有效性和可靠性。死亡細胞不具備正常的生物活性和功能，因此分選到活細胞可以確保后續(xù)實驗能夠反映真實的細胞生物學狀態(tài)。

圖3 無死細胞排除處理的樣本分析比較

圖4 有死細胞排除處理的樣本分析比較

復蘇后的PBMC在免疫染色之前不添加（圖 3）或者添加ViaKrome 405可固定活性染料（55℃，10分鐘）（圖 4）。然后，使用Perfix-nc細胞染色試劑盒（型號 B10825）處理細胞，并用Granzyme B-FITC、CD19-PE、CD14-ECD、CD79a-PC5.5、CD3-PC7 和 CD45- Krome Orange 進行染色。 

數(shù)據(jù)統(tǒng)計信息顯示：兩個不同條件下，門內(nèi)細胞在上一門級百分比也不一樣，充分展示了消除死細胞以后的數(shù)據(jù)效果。