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- 你的我在哪 2009-03-25 00:00:00
- 蛋白定量分析，現(xiàn)在都有很多的現(xiàn)成的試劑盒，像bradford蛋白定量試劑盒，BCA蛋白定量試劑盒等等。很簡單按說明書來就行。我用過北京創(chuàng)根勝泰的BCA挺方便的。
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- 淡然淺笑zz 2009-03-21 00:00:00
- ZG藥典推薦的方法是Lorry法。蛋白質(zhì)與堿性銅溶液中的Cu2+絡(luò)和使得肽鍵伸展，從而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在堿性銅條件下與福林試劑反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色，在一定濃度范圍內(nèi)，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比，由于各種蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在測定時需使用同種蛋白質(zhì)作標(biāo)準(zhǔn)。 美國fda藥典推薦的是Bradford法，蛋白質(zhì)與染料考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合，在一定的線性范圍內(nèi)，反應(yīng)液595nm處吸光度的變化量與反應(yīng)蛋白量成正比，測定595nm處吸光度的增加即可進(jìn)行蛋白定量。 兩者大多數(shù)情況下是都能給較為精確的對蛋白質(zhì)定量。
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- 花朵朵的哆哆 2016-12-01 20:36:40
- 蛋白質(zhì)的定量定主要有直接紫外吸收法、Bradford法和Lorry法三種。 蛋白質(zhì)中存在著含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，所以任何一個蛋白質(zhì)都具有280nm附近的紫外吸收峰，在此波長范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光密度OD280nm與其濃度呈正比關(guān)系。 改良的Bradford法，蛋白質(zhì)與染料考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合，在一定的線性范圍內(nèi)，反應(yīng)液595nm處吸光度的變化量與反應(yīng)蛋白量成正比，測定595nm處吸光度的增加即可進(jìn)行蛋白定量。 Lorry法。蛋白質(zhì)與堿性銅溶液中的Cu2+絡(luò)和使得肽鍵伸展，從而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在堿性銅條件下與福林試劑反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色，在一定濃度范圍內(nèi)，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比，由于各種蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在測定時需使用同種蛋白質(zhì)作標(biāo)準(zhǔn)。 總RNA和DNA都可以用紫外分光光度計在260nm和280nm處測定吸光度值進(jìn)行濃度換算，dsDNA換算系數(shù)為50，RNA為40，oligoDNA20，ssDNA約為37.此外260nm/280nm的比值還可以反映出RNA和DNA的純度。RNA比值應(yīng)在2.0而DNA在1.8左右 mRNA的定量需要借助其他生物方法，現(xiàn)在Z常用的就是qPCR，就是定量PCR.其中有Z常用的是real-time PCR 這種方法可以相對定量或者定量出mRNA的表達(dá)水平.
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做Western Blot的小伙伴，是不是還在為歸一化方法而糾結(jié)呢？今天小編就和大家匯總一下看家蛋白和總蛋白歸一化的方法。
看家蛋白歸一化
使用看家蛋白的缺點(diǎn)是在樣品間和不同條件下表達(dá)水平可能不一致。如使用看家蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，必須先花費(fèi)時間和精力來驗證內(nèi)參的選擇。
使用看家蛋白的第二個重大挑戰(zhàn)是它們的表達(dá)豐度很高，如果樣品中的看家蛋白表達(dá)非常高，這會限制在凝膠上加載的樣品量，如果感興趣的蛋白不是同樣的表達(dá)豐度，那這兩種蛋白質(zhì)就不在同一線性檢測范圍內(nèi)。
如果您正在進(jìn)行多重蛋白印跡，例如比較同一蛋白質(zhì)的磷酸化和非磷酸化形式，則需要考慮的第三個挑戰(zhàn)是從不同物種中產(chǎn)生一抗和二抗的復(fù)雜性。
檢測的看家蛋白可能干擾感興趣蛋白的檢測。理想情況下，看家蛋白應(yīng)該與感興趣蛋白的大小不同，因此這兩種蛋白可在印跡上空間分辨。當(dāng)實驗在同一印跡上檢查多種目的蛋白時，這就變得越來越困難。
總蛋白歸一化
使用總蛋白歸一化，是直接在膜上檢測總蛋白，并且該值在歸一化時用作分母。總蛋白染色提供更寬的動態(tài)范圍，并且表現(xiàn)出比看家蛋白更低的可變性和更準(zhǔn)確的定量數(shù)據(jù)。
與使用看家蛋白相比，圖像采集后的分析工作流程基本不變; 整個泳道或泳道中大部分信號用于歸一化，而不是單一的條帶。
例如：JBC、Narute和Proteomics等期刊會推薦使用總蛋白歸一化方法。
使用總蛋白染色劑對膜進(jìn)行染色提供了質(zhì)控優(yōu)勢，可以驗證轉(zhuǎn)印是否完全。
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