術(shù)中OCT提高視網(wǎng)膜下基因增強(qiáng)治 療的手術(shù)安全性和治 療準(zhǔn)確性

基因增強(qiáng)治 療是一種眼部基因轉(zhuǎn)移方法，用于治 療當(dāng)功能蛋白不足表現(xiàn)為遺傳病時(shí)的常染色體隱性或X性染色體連鎖視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良。這些基因缺陷引發(fā)特定視力障礙和/或視網(wǎng)膜變性。

近期，基因治 療在視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良中的應(yīng)用引發(fā)了人們巨大的興趣。視網(wǎng)膜下基因治 療藥物注射術(shù)的技術(shù)要求較高，具有一定難度。術(shù)中光學(xué)相干斷層掃描（術(shù)中OCT）可提供實(shí)時(shí)信息并向外科醫(yī)生提供反饋，包括對眼后段結(jié)構(gòu)的滲透深度、注射液的分布和傳播、載體回流以及術(shù)中黃斑中心凹的完整性。

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術(shù)中光學(xué)相干斷層掃描（OCT）輔助下Leber先天性黑矇（LCA）黃斑修復(fù)術(shù)

病例研究的內(nèi)容

Leber先天性黑矇（LCA）是一組先天性視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良，可導(dǎo)致早年出現(xiàn)重度視力損傷?；颊咄ǔ１憩F(xiàn)為眼球震顫、瞳孔反應(yīng)遲鈍或近乎缺失、視力嚴(yán)重下降、畏光和高度遠(yuǎn)視[1]。眼部基因治 療可極大改善這些患者的視力[2]。通過術(shù)中視網(wǎng)膜下注射AAV載體完成基因傳遞。

視網(wǎng)膜下眼部基因治 療注射對準(zhǔn)確度水平有較高要求。因此，術(shù)中光學(xué)相干斷層掃描（OCT）是一項(xiàng)必不可少的工具。術(shù)中OCT可向眼科醫(yī)生提供實(shí)時(shí)信息，支持氣泡管理，并可用于確認(rèn)預(yù)期的載體量是否到達(dá)視網(wǎng)膜下間隙。術(shù)中OCT還有助于預(yù)防并發(fā)癥，例如載體注射期間術(shù)中形成的黃斑裂孔。

病例研究中值得期待的內(nèi)容

學(xué)習(xí)要點(diǎn)

• 了解21歲視網(wǎng)膜變性及2型Leber先天性黑矇（LCA）患者的手術(shù)治 療

• 發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜下眼部基因治 療注射的不同步驟

• 理解術(shù)中OCT在黃斑修復(fù)術(shù)中的作用

眼部基因治 療病例描述

1例21歲西班牙裔女性，自出生以來視力不良，包括夜盲癥、視野收縮、視力下降和色覺下降?；颊咦⒁獾匠霈F(xiàn)緩慢的進(jìn)行性功能性退減。盡管已完成高中學(xué)業(yè)，但她的方向感日益惡化，并且由于視力限制無法獨(dú)立生活和工作。

圖1：圖注：黃斑OCT和超寬視野眼底圖像顯示基線色素性視網(wǎng)膜病變和相對保留中央凹的感光器改變。圖像由A博士提供

診斷與術(shù)前評估

雙眼術(shù)前視力均為20/150?；颊弑憩F(xiàn)為典型彌散性視網(wǎng)膜變性，黃斑相對保留。基因檢測顯示雙等位基因RPE65變異導(dǎo)致視網(wǎng)膜變性，并提示2型Leber先天性黑矇。鑒于可獲得視網(wǎng)膜活細(xì)胞且考慮到眼部基因治 療的潛在受益，對雙眼進(jìn)行了視網(wǎng)膜下注射治 療。兩次手術(shù)之間間隔兩周。黃斑OCT和超寬視野眼底圖像顯示基線色素性視網(wǎng)膜病變和相對保留中央凹的感光器改變。

圖2：進(jìn)行黃斑掃描以記錄注射前解剖結(jié)構(gòu)，圖像由A博士提供

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來自視網(wǎng)膜、玻璃體和黃斑疾病治療醫(yī)師A博士的經(jīng)驗(yàn)：

采訪中，A博士詳細(xì)講述了自己使用帶有內(nèi)置術(shù)中OCT的眼科顯微鏡經(jīng)驗(yàn)。他表示，眼科顯微鏡在糖尿病患者治療中是一種非常有用的工具。使用內(nèi)置OCT的眼科顯微鏡，可以可視化黃斑，了解是否存在黃斑裂孔、視網(wǎng)膜前膜和其它可能存在于視網(wǎng)膜表面的牽引性膜。A博士是位于某市區(qū)的視網(wǎng)膜中心的視網(wǎng)膜疾病專家。

*本視頻采訪中所述的觀點(diǎn)僅代表相關(guān)醫(yī)師的個(gè)人意見，并不一定代表其所屬的機(jī)構(gòu)的觀點(diǎn)。

采訪轉(zhuǎn)錄

A博士，是一位視網(wǎng)膜疾病專家。某市視網(wǎng)膜中心專注于研究視網(wǎng)膜內(nèi)科和外科疾病，在某都市區(qū)設(shè)有診療機(jī)構(gòu)。在此之前的十多年中，曾在某大學(xué)的眼科研究所擔(dān)任教職，負(fù)責(zé)培訓(xùn)視網(wǎng)膜領(lǐng)域的研究員。在醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療，經(jīng)常使用特定的眼科顯微鏡。

實(shí)際上，醫(yī)生們很早便開始使用眼科顯微鏡了。A博士在擔(dān)任住院醫(yī)生和研究員期間就提供過相關(guān)的培訓(xùn)，臨床治療中也有使用。因此，當(dāng)醫(yī)生要升級手術(shù)室顯微鏡時(shí)，醫(yī)生自然希望嘗試zuixin款的眼科顯微鏡。現(xiàn)在A博士要分享一款眼科顯微鏡。A博士所在醫(yī)院早在2018年初便引進(jìn)了一款眼科顯微鏡。 它的清晰度更高，景深更大，這一點(diǎn)令醫(yī)生感觸頗深。此外，它還能夠很好地集成非接觸眼底廣角觀察系統(tǒng)，整個(gè)流程都是無縫式操作。最為重要的一點(diǎn)是集成的術(shù)中OCT技術(shù)或EnFocus系統(tǒng)。醫(yī)生已經(jīng)在很多手術(shù)中使用過，效果非常好。

可以說，EnFocus已經(jīng)成為醫(yī)生的一項(xiàng)重要工具。熟練操作后，會發(fā)現(xiàn)它的優(yōu)勢也越來越多。在糖尿病玻璃體切割術(shù)中，醫(yī)生尤其會使用到它。對于部分患有糖尿病玻璃體積血的患者，當(dāng)在門診進(jìn)行檢查時(shí)，很多時(shí)候，他們的視力都極其有限，無法清晰地看到他們的視網(wǎng)膜黃斑。一旦這些患者進(jìn)入手術(shù)室，醫(yī)生將積血清除后，便可以看到視網(wǎng)膜黃斑，對這些患者進(jìn)行OCT，可以幫助醫(yī)生了解是否存在黃斑裂孔、視網(wǎng)膜前膜和其它可能存在于視網(wǎng)膜表面的牽引性膜。因此，在糖尿病患者治療中，眼科顯微鏡的效果非常好。

針對糖尿病牽引性視網(wǎng)膜脫離的情況，當(dāng)醫(yī)生嘗試確定解剖面時(shí)，術(shù)中OCT非常好用。 醫(yī)生還會將其用于黃斑下出血的情況，在這種情況下，醫(yī)生會用它來取代視網(wǎng)膜下組織型纖維蛋白溶酶原激活劑。眼科顯微鏡可以幫助醫(yī)生進(jìn)行定位。它還可以幫助進(jìn)行玻璃體黃斑牽引，確保在手術(shù)結(jié)束時(shí)釋放存在的任何牽引。基因治療是另一個(gè)它可以發(fā)揮重要作用的領(lǐng)域?，F(xiàn)在越來越多的面向視網(wǎng)膜下間隙領(lǐng)域的基因治療藥物正在進(jìn)入臨床研究階段。 所以，未來術(shù)中OCT將成為視網(wǎng)膜下間隙定位以及基因藥物給藥的關(guān)鍵應(yīng)用。

眼科顯微鏡的腳踏開關(guān)是醫(yī)生喜歡的一項(xiàng)功能。它采用完全定制化設(shè)計(jì)，可以用于控制眼科顯微鏡的各個(gè)方面和術(shù)中OCT模式。醫(yī)生可以使用腳踏開關(guān)，根據(jù)需求靈活地打開和關(guān)閉OCT模式，還可以調(diào)整OCT的焦距。靈活方便的操控會給人帶來很好的使用體驗(yàn)。眼科顯微鏡的可視化也是醫(yī)生非常喜歡的一個(gè)功能。在觀察眼后節(jié)或使用雙目鏡時(shí)，融合光學(xué)可以提高清晰度、優(yōu)化景深。 它與非接觸眼底廣角觀察系統(tǒng)無縫集成。這個(gè)特性有助于改進(jìn)工作流，例如當(dāng)醫(yī)生開始進(jìn)行玻璃體切除術(shù)時(shí)，顯微鏡的光線會關(guān)閉，自動(dòng)倒像。這類模式極大地優(yōu)化了我們的工作流程。

助手鏡也有亮點(diǎn)。在與住院醫(yī)生和研究員合作時(shí)，醫(yī)生經(jīng)常會使用助手鏡，在這個(gè)方面，眼科顯微鏡有一個(gè)很大的優(yōu)勢，就是在助手鏡中看到的和從主刀鏡中看到的視野是完全一樣的。 這一點(diǎn)非常有用。最后一點(diǎn)是記錄，在工作中，醫(yī)生經(jīng)常需要錄制手術(shù)過程和編輯視頻，借助高清攝像頭和好的記錄系統(tǒng)，我可以連接外接硬盤并在聯(lián)機(jī)狀態(tài)下進(jìn)行編輯，不僅高效，而且成片質(zhì)量很高。

眼科顯微鏡和EnFocus OCT有助于改進(jìn)臨床效果，尤其是在糖尿病玻璃體切除術(shù)中。就像前面所說，借助視網(wǎng)膜黃斑狀態(tài)的實(shí)時(shí)信息，醫(yī)生可以更好地制定手術(shù)決策。簡而言之，它有很多實(shí)用性功能，醫(yī)生可以親自體驗(yàn)一下。在臨床評估中，眼科顯微鏡和EnFocus的優(yōu)勢尤其明顯，使用術(shù)中OCT，醫(yī)生可以獲得高的清晰度，更好地發(fā)揮技術(shù)優(yōu)勢，而且用順手后，會逐漸發(fā)現(xiàn)越來越多的優(yōu)勢。

眼科手術(shù)必須滿足高精 準(zhǔn)度的要求，才能讓手術(shù)操作和組織操作達(dá)到理想效果。在幫助眼外科醫(yī)師在眼科手術(shù)中獲得高精 準(zhǔn)度和提升手術(shù)效果方面，眼科手術(shù)顯微鏡發(fā)揮著重要的作用。

關(guān)鍵經(jīng)驗(yàn)

醫(yī)生在眼科手術(shù)中使用內(nèi)置于眼科手術(shù)顯微鏡的EnFocus術(shù)中OCT成像系統(tǒng)，獲得了更加清晰的手術(shù)視野。借助這一先進(jìn)的技術(shù)，眼科醫(yī)生可以看到眼底下組織的細(xì)節(jié)，并在手術(shù)過程中實(shí)時(shí)確認(rèn)組織對手術(shù)操作的反應(yīng)。

醫(yī)生介紹了EnFocus術(shù)中OCT成像系統(tǒng)為白內(nèi)障手術(shù)分析提供的多種優(yōu)勢。介紹了成像系統(tǒng)如何有助于在白內(nèi)障手術(shù)中獲得理想的精 準(zhǔn)度，包括手術(shù)過程中準(zhǔn)確評估切口結(jié)構(gòu)

關(guān)于EnFocus

EnFocus是用于眼科手術(shù)顯微鏡的術(shù)中OCT。它可以呈現(xiàn)出高度清晰的實(shí)時(shí)眼前節(jié)和眼后節(jié)圖像，便于觀察眼底下表面顯微結(jié)構(gòu)。除了角膜移植術(shù)和白內(nèi)障手術(shù)，在角膜、青光眼和視網(wǎng)膜手術(shù)中，術(shù)中OCT同樣可以提供相同的優(yōu)勢。它也是基因治 療中一項(xiàng)重要的輔助工具。EnFocus可以結(jié)合眼科手術(shù)顯微鏡使用，提供全面的可視化效果。

*免責(zé)聲明：本文中醫(yī)療專業(yè)人員的陳述和解釋僅代表其個(gè)人觀點(diǎn)和經(jīng)驗(yàn)，并不代表其所屬機(jī)構(gòu)的觀點(diǎn)。

現(xiàn)介紹OCT另外一種有趣的用途。它可以在白內(nèi)障手術(shù)中提供寶貴的切口結(jié)構(gòu)信息。

手術(shù)開始階段的切口結(jié)構(gòu)分析

從眼科手術(shù)開始階段，術(shù)中OCT便可以提供關(guān)于切口結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確信息。醫(yī)生可以準(zhǔn)確地確定切口長度以及淺表和深部皮瓣的厚度。我們可以同時(shí)對縱斷面和橫斷面進(jìn)行分析。

切口分析：縫合前

這里，醫(yī)生可以在手術(shù)結(jié)束后分析切口的結(jié)構(gòu)。在縫合前，注意到切口的橫斷面呈不規(guī)則的橢圓形。

切口分析：縫合中

切口經(jīng)過了調(diào)整?？梢钥吹剿臋M斷面呈更加明顯的橢圓形。在縱斷面上，可以看到一個(gè)更筆直的切口，而且內(nèi)外部都有間隙。

切口分析：縫合中和縫合后

醫(yī)生可以使用術(shù)中OCT來分析縫合過程中切口結(jié)構(gòu)的變化。注意到切口的路徑消失了，隱于角膜水腫之中。在這里，可以看到縫合前和縫合后的切口。

切口分析：非密封切口的特點(diǎn)

當(dāng)醫(yī)生分析密封切口時(shí)，切口的路徑是不可見的。注意到角膜的前表面曲率是比較規(guī)則的，而角膜后表面的角膜水腫則伴有隆起。

在非密封切口中，盡管已經(jīng)完成了縫合，醫(yī)生注意到在這種情況下仍然存在內(nèi)部間隙和局部后彈力層脫離。

在這種情況下，盡管已經(jīng)縫合，但切口的路徑仍然可見。醫(yī)生還可以分析橫斷面。在這種情況下，觀察到切口結(jié)構(gòu)是傾斜的。這就解釋了為何切口是未密封的。

切口分析：縫合后

縫合非密封切口時(shí)，它的路徑變得不可見。尤其要注意前表面曲率幾乎沒有變化。因此，曲率調(diào)整主要針對于后表面，它變成了一個(gè)雙凸點(diǎn)。

結(jié)論：

提高白內(nèi)障手術(shù)的質(zhì)量

根據(jù)醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)，術(shù)中OCT可以提供很多有趣的切口結(jié)構(gòu)信息。它是實(shí)現(xiàn)更加細(xì)致和準(zhǔn)確的分析的有效工具，有助于提升白內(nèi)障手術(shù)的質(zhì)量、精 準(zhǔn)性和整體效果。

憑借顯著優(yōu)化視野的高jingzhun性和同步性，眼科手術(shù)顯微鏡術(shù)中OCT成像系統(tǒng)可以幫助眼科醫(yī)生在眼科手術(shù)中實(shí)現(xiàn)高水準(zhǔn)的手術(shù)效果。

眼外科醫(yī)生分享了在白內(nèi)障和視網(wǎng)膜手術(shù)中使用眼科手術(shù)顯微鏡術(shù)中OCT的經(jīng)驗(yàn)。

關(guān)鍵經(jīng)驗(yàn)

眼科手術(shù)顯微鏡有一種內(nèi)置術(shù)中OCT的高級成像解決方案，設(shè)計(jì)用于改善眼前后節(jié)手術(shù)的工作流程，實(shí)現(xiàn)高精準(zhǔn)度。

醫(yī)生分享了在白內(nèi)障手術(shù)中使用眼科手術(shù)顯微鏡術(shù)中OCT成像系統(tǒng)的體驗(yàn)。醫(yī)生特別強(qiáng)調(diào)了使用這款成像解決方案在檢測和處理殘余晶狀體碎片的優(yōu)勢。由于這些晶狀體碎片會被手術(shù)切口或水腫遮擋，因此很難看到。眼科手術(shù)顯微鏡術(shù)中OCT可以有效定位殘留晶狀體碎片，從而改善手術(shù)效果，降低術(shù)后并發(fā)癥和二次手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān) 于 EnFocus

EnFocus是用于眼科手術(shù)顯微鏡的術(shù)中OCT。它可以呈現(xiàn)出高度清晰的實(shí)時(shí)眼前節(jié)和眼后節(jié)圖像，便于觀察眼底下表面顯微結(jié)構(gòu)。除了角膜移植術(shù)和白內(nèi)障手術(shù)，在角膜、青光眼和視網(wǎng)膜手術(shù)中，術(shù)中OCT同樣可以提供相同的優(yōu)勢。它也是基因治療中一項(xiàng)重要的輔助工具。EnFocus可以結(jié)合眼科手術(shù)顯微鏡使用，提供全面的可視化效果。

免責(zé)聲明：本文中醫(yī)療專業(yè)人員的陳述和解釋僅代表其個(gè)人觀點(diǎn)和經(jīng)驗(yàn)，并不代表其所屬機(jī)構(gòu)的觀點(diǎn)。

殘留晶狀體碎片評估

除了視網(wǎng)膜手術(shù)這一典型的適用領(lǐng)域，術(shù)中OCT在白內(nèi)障手術(shù)中也能夠發(fā)揮重要的作用，尤其是用于評估殘留晶狀體碎片。

手術(shù)結(jié)束時(shí)，我懷疑存在晶狀體碎片。借助術(shù)中OCT，可以突出顯示殘留碎片。碎片尺寸較大，隱藏在主切口的水腫后面。

當(dāng)碎片尺寸相對較小，隱藏在輔助切口后面。然而，這些碎片受切口附近的角膜水腫影響，很難發(fā)現(xiàn)。這時(shí)候術(shù)中OCT便可以發(fā)揮重要的作用。

一般是對眼后節(jié)進(jìn)行360°環(huán)形掃描。使用顯微鏡腳踏開關(guān)，可以返回手術(shù)區(qū)域并分析圖像。這樣就可以看到輔助切口水腫后面有一個(gè)隱藏的殘留碎片。

在別的眼科手術(shù)中也能看到虹膜角膜角度有微小的殘留碎片。

術(shù)中OCT的優(yōu)勢

在眼科手術(shù)中，術(shù)中OCT可以在白內(nèi)障手術(shù)中發(fā)揮重要的作用。醫(yī)生可以用它發(fā)現(xiàn)殘留碎片，避免幾天或幾周后進(jìn)行二次手術(shù)，還可以減少術(shù)后并發(fā)癥。所以說，術(shù)中OCT是一種提高白內(nèi)障手術(shù)質(zhì)量和完善性的有效工具。

會議概況

BIONNOVA 細(xì)胞與基因治 療廣州論壇將于 2023 年 2 月 21-22 日在廣州舉辦，本次論壇就當(dāng)前免疫細(xì)胞、干細(xì)胞、溶瘤病毒、基因編輯等研發(fā)路線上的進(jìn)展和突破、創(chuàng)新療法的注冊申報(bào)和臨床開發(fā)、細(xì)胞與基因治 療生產(chǎn)工藝的技術(shù)突破、以及藥物開發(fā)過程中的分析和質(zhì)控等議題展開探討。

會議時(shí)間：

2023 年 2 月 21 日 - 22 日

會議地點(diǎn)：

廣州翡翠希爾頓酒店

會議日程：

安捷倫作為本次會議的參展商，細(xì)胞分析部門將攜“基因與細(xì)胞治 療創(chuàng)新性解決方案”，在A08展臺期待大家的蒞臨。

第三期：

術(shù)中OCT：基因治 療程序的專家見解

課程簡介：

來自英國倫敦摩菲眼科醫(yī)院和大奧蒙德街兒童醫(yī)院的 Robert Henderson 醫(yī)師和來自比利時(shí)根特大學(xué)醫(yī)院的Fanny Nerinckx 博士將解釋術(shù)中OCT如何支持基因治 療程序以及它如何為外科醫(yī)生提供有價(jià)值的信息。他們將各自分享他們實(shí)踐中的臨床案例。

講者：

Mr. Robert Henderson

高級眼科顧問醫(yī)師

倫敦摩菲眼科醫(yī)院和大奧蒙德街兒童醫(yī)院

英國

Dr. Fanny Nerinckx

前后節(jié)眼科醫(yī)師

根特大學(xué)醫(yī)院   比利時(shí)

第二期：

術(shù)中OCT提升您的手術(shù)體驗(yàn)：視網(wǎng)膜下注射基因治 療

課程簡介：

術(shù)中 OCT 在您的視網(wǎng)膜手術(shù)中發(fā)揮作用，實(shí)時(shí)揭示表面下隱藏的細(xì)節(jié)。位于俄亥俄州辛辛那提的辛辛那提眼科研究所和辛辛那提兒童醫(yī)院的醫(yī)學(xué)博士 Robert Sisk 將討論他們?nèi)绾卧谌粘?shí)踐中使用配備 OCT 手術(shù)顯微鏡。通過將術(shù)中 OCT 整合到他們的實(shí)踐中，Sisk 博士和 Davis 博士能夠在復(fù)雜的手術(shù)過程中更有信心地進(jìn)行手術(shù)，從而提升手術(shù)經(jīng)驗(yàn)和患者的治療 效果。

講者：

Robert A. Sisk  博士

辛辛那提兒童醫(yī)院眼科研究中心  美國

第四期：

前節(jié)手術(shù)的技術(shù)趨勢：術(shù)中OCT與3D可視化手術(shù)

課程簡介：

來自英國南安普頓大學(xué)醫(yī)院的David Anderson醫(yī)師和來自羅馬尼亞Oculus 眼科診所的Ozana Moraru博士將分享新興技術(shù)趨勢如何改變眼前節(jié)手術(shù)。他們將通過臨床病例和手術(shù)視頻討論術(shù)中OCT和3D的價(jià)值。

講者：

Mr. David Anderson   

高級眼科顧問醫(yī)師

南安普頓大學(xué)醫(yī)院   英國

Dr. Ozana Moraru

眼科醫(yī)師

歐科路斯眼科診所  羅馬尼亞

最近一段時(shí)間，隨著疾病診療的精 準(zhǔn)化，各個(gè)版本新冠診療指南的出爐，淋巴細(xì)胞亞群、精細(xì)亞群和細(xì)胞因子等與免疫力監(jiān)控高度相關(guān)的指標(biāo)受到了高度關(guān)注。

在眾多的免疫指標(biāo)中，選擇哪些監(jiān)測指標(biāo)，如何建立自建方案并驗(yàn)證，如何建立與疾病診療相關(guān)指標(biāo)的Cutoff值，這些都是當(dāng)下流式工作者們開展更多免疫指標(biāo)時(shí)會遇到的一些難題。下面這篇文章對上面提到的幾個(gè)問題做了詳細(xì)的解答。

01.背景介紹

免疫檢查點(diǎn)抑 制劑治 療，特別是聯(lián)合PD-1/CTLA-4 阻斷，顯著提高了轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的治 療率和總生存率 。但同時(shí)，與免疫相關(guān)的不良反應(yīng)，如肝炎和結(jié)腸炎，是免疫抑 制劑治 療過程中常見的并發(fā)癥，其嚴(yán)重的時(shí)候可以危及到生命 。在接受PD-1和CTLA-4的一些晚期黑色素瘤患者中，巨細(xì)胞病毒 (CMV)引起的特異性記憶 T 細(xì)胞反應(yīng)會導(dǎo)致肝損傷，而有研究表明治 療前血液中 CD4+ 效應(yīng)記憶 T 細(xì)胞 (TEM) 的擴(kuò)增能夠可靠地預(yù)測肝炎；所以如果有一種方案可以監(jiān)測效應(yīng)記憶T細(xì)胞，從而預(yù)測不良反應(yīng)的發(fā)生，其將具有很好的臨床意義。

本文章作者開發(fā)并驗(yàn)證了一個(gè)10色流式細(xì)胞方案，用于可靠地量化外周血樣本中的 CD4+ TEM細(xì)胞和其他 irAE 風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)志物。與以前的方案相比，文章作者的新方案在測量CD4+ TEM細(xì)胞方面表現(xiàn)出色，并且在從CD4+ CD197+ CD45RA+ 幼稚T細(xì)胞（Na?ve T）分辨CD4+ CD197+ CD45RA- 中 央記憶T細(xì)胞 (TCM) 方面表現(xiàn)出色。它還能夠精確量化 CD14+單核細(xì)胞。

02.實(shí)驗(yàn)方案

CD4+ TEM細(xì)胞的標(biāo)記為CD45+ CD3+ CD4+ CD8- CD45RA- CD197- 。單核細(xì)胞的相同標(biāo)記為 CD45+CD14+，同時(shí)加上將 CD16，以對經(jīng)典、中間和非經(jīng)典單核細(xì)胞進(jìn)行更精細(xì)的分類。有研究表明將 CD8+ T 細(xì)胞中的 CD279 (PD-1) 表達(dá)確定為黑色素瘤患者接受 PD-1/CTLA-4 治 療后臨床反應(yīng)的標(biāo)志物 ，因此加上 CD45+ CD3+ CD4- CD8+ CD279+ 。為了提高細(xì)胞類型定義的準(zhǔn)確性，方案中還包括了一個(gè)譜系排除 (Lin) 通道（CD19、CD20、CD56 和 CD66b）來排除B 細(xì)胞、NK 細(xì)胞和粒細(xì)胞。因此，新panel包括 10 個(gè)參數(shù)：CD45、Lin、CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD197 (CCR7)、CD279 (PD-1)、CD14 和 CD16，作者將該方案命名為“monocyte and T cell”，簡稱“MoT”。

該方案用Beckman Coulter的液體試劑進(jìn)行驗(yàn)證，并在驗(yàn)證完成后，作者將該方案定制成干粉形式，由于干粉產(chǎn)品相比較液體試劑，不僅可室溫保存，并且保存時(shí)間更久，同時(shí)還可以減少實(shí)驗(yàn)操作，樣本間一致性也更高等優(yōu)點(diǎn)，便于日常診斷工作并最 大限度地減少差異。

貝克曼庫爾特公司不僅可以提供Duraclone干粉成品試劑，還可以提供客戶定制CDS，可以根據(jù)客戶需求，個(gè)性化組合定制干粉方案。相比較液體方案來說，定制化的干粉組合方案，不僅有液體單抗方案的自由組合的優(yōu)點(diǎn)，而且還有干粉試劑的優(yōu)點(diǎn)。

03.方案圈門策略

該方案用貝克曼庫爾特公司的Navios 3激光10色儀器進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集，并使用Kaluza軟件進(jìn)行分析。

3.1  對CD45+ 白細(xì)胞進(jìn)行圈門；

3.2  對CD3+ T 細(xì)胞和CD3- 細(xì)胞進(jìn)行圈門；

3.3  對CD3-內(nèi)的譜系陰性 (Lin-) 細(xì)胞進(jìn)行圈門；對CD14+ 單核細(xì)胞進(jìn)行圈門；對由 CD14 和 CD16 表達(dá)定義的單核細(xì)胞亞群進(jìn)行圈門；

3.4  對CD3+ T 細(xì)胞內(nèi)的CD4+ 和 CD8+ T細(xì)胞進(jìn)行圈門；對CD4+ 記憶T細(xì)胞亞群進(jìn)行圈門；圈門CD279+ CD8+ T細(xì)胞。

04.檢測性能驗(yàn)證

文章作者將此方案與貝克曼庫爾特公司的DURAClone IM T 細(xì)胞亞群管 和 DURAClone IM Basic管平行分析了來自 83 名患有II、III 或 IV期疾病的黑色素瘤患者的樣本，其中II 期(n = 52)、III期(n = 11) 或IV期(n = 20)。除CD14+ 單核細(xì)胞外，其他參數(shù)均觀察到方法之間的強(qiáng)相關(guān)性，CD14+ 單核細(xì)胞顯示出中等相關(guān)性。

DURAClone IM Basic和DURAClone IM T是貝克曼庫爾特公司的Duraclone IM全套抗體組合方案中的第1管與第3管。該產(chǎn)品的優(yōu)點(diǎn)是干粉，保存的時(shí)間比液體更久；而且預(yù)混抗體也能節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，相比于自己混勻抗體后分裝染色，樣本間的一致性會更高。產(chǎn)品質(zhì)量滿足ISO 9001認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)（ISO 9001-2008）。

文章作者之前確立了一個(gè)cutoff值≥16% CD4+ TEM 細(xì)胞作為 CMV Ig+ 患者檢查點(diǎn)阻斷相關(guān)肝炎的預(yù)測因子。因此在將患者分類為 CD4+ TEM ≥16% 或 CD4+ TEM <16% 時(shí)，DURAClone IM T 細(xì)胞亞群管和 MoT測試管結(jié)果在 81/83 例 (98%) 中一致。此外，E圖顯示在確定 CMV 血清學(xué)狀態(tài)，并在治 療開始后 12 周內(nèi)評估免疫相關(guān)肝炎的發(fā)展。紅色虛線表示 CD4+ TEM ≥ 16% 的cutoff值， 中值用黑線表示，MoT 方案在預(yù)測 16 名 IV 期黑色素瘤患者的肝炎方面表現(xiàn)良好。F圖顯示6 名 CMV IgG+ CD4+ TEM ≥16% 黑色素瘤患者中有 5 名正確預(yù)測了肝炎。

經(jīng)過驗(yàn)證，文章作者用cutoff值≥16% CD4+ TEM 細(xì)胞作為 CMV Ig+ 患者檢查點(diǎn)阻斷相關(guān)肝炎的預(yù)測因子，相關(guān)的PPV=83%，NPV=80%。

另外，文章作者還從批內(nèi)精密度、批間精密度、操作者間分析精度、樣本穩(wěn)定性、樣本染色穩(wěn)定性、年齡、性別和疾病相關(guān)偏倚、季節(jié)性等方面進(jìn)行了驗(yàn)證，確保該方案結(jié)果是在可接受范圍內(nèi)的，由于篇幅的關(guān)系，就不一一列出來了，感興趣的讀者可以去原文查看，其詳細(xì)的介紹了作者驗(yàn)證思路與結(jié)果。