最近一段時間，隨著疾病診療的精 準(zhǔn)化，各個版本新冠診療指南的出爐，淋巴細(xì)胞亞群、精細(xì)亞群和細(xì)胞因子等與免疫力監(jiān)控高度相關(guān)的指標(biāo)受到了高度關(guān)注。

在眾多的免疫指標(biāo)中，選擇哪些監(jiān)測指標(biāo)，如何建立自建方案并驗(yàn)證，如何建立與疾病診療相關(guān)指標(biāo)的Cutoff值，這些都是當(dāng)下流式工作者們開展更多免疫指標(biāo)時會遇到的一些難題。下面這篇文章對上面提到的幾個問題做了詳細(xì)的解答。

01.背景介紹

免疫檢查點(diǎn)抑 制劑治 療，特別是聯(lián)合PD-1/CTLA-4 阻斷，顯著提高了轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的治 療率和總生存率 。但同時，與免疫相關(guān)的不良反應(yīng)，如肝炎和結(jié)腸炎，是免疫抑 制劑治 療過程中常見的并發(fā)癥，其嚴(yán)重的時候可以危及到生命 。在接受PD-1和CTLA-4的一些晚期黑色素瘤患者中，巨細(xì)胞病毒 (CMV)引起的特異性記憶 T 細(xì)胞反應(yīng)會導(dǎo)致肝損傷，而有研究表明治 療前血液中 CD4+ 效應(yīng)記憶 T 細(xì)胞 (TEM) 的擴(kuò)增能夠可靠地預(yù)測肝炎；所以如果有一種方案可以監(jiān)測效應(yīng)記憶T細(xì)胞，從而預(yù)測不良反應(yīng)的發(fā)生，其將具有很好的臨床意義。

本文章作者開發(fā)并驗(yàn)證了一個10色流式細(xì)胞方案，用于可靠地量化外周血樣本中的 CD4+ TEM細(xì)胞和其他 irAE 風(fēng)險的生物標(biāo)志物。與以前的方案相比，文章作者的新方案在測量CD4+ TEM細(xì)胞方面表現(xiàn)出色，并且在從CD4+ CD197+ CD45RA+ 幼稚T細(xì)胞（Na?ve T）分辨CD4+ CD197+ CD45RA- 中 央記憶T細(xì)胞 (TCM) 方面表現(xiàn)出色。它還能夠精確量化 CD14+單核細(xì)胞。

02.實(shí)驗(yàn)方案

CD4+ TEM細(xì)胞的標(biāo)記為CD45+ CD3+ CD4+ CD8- CD45RA- CD197- 。單核細(xì)胞的相同標(biāo)記為 CD45+CD14+，同時加上將 CD16，以對經(jīng)典、中間和非經(jīng)典單核細(xì)胞進(jìn)行更精細(xì)的分類。有研究表明將 CD8+ T 細(xì)胞中的 CD279 (PD-1) 表達(dá)確定為黑色素瘤患者接受 PD-1/CTLA-4 治 療后臨床反應(yīng)的標(biāo)志物 ，因此加上 CD45+ CD3+ CD4- CD8+ CD279+ 。為了提高細(xì)胞類型定義的準(zhǔn)確性，方案中還包括了一個譜系排除 (Lin) 通道（CD19、CD20、CD56 和 CD66b）來排除B 細(xì)胞、NK 細(xì)胞和粒細(xì)胞。因此，新panel包括 10 個參數(shù)：CD45、Lin、CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD197 (CCR7)、CD279 (PD-1)、CD14 和 CD16，作者將該方案命名為“monocyte and T cell”，簡稱“MoT”。

該方案用Beckman Coulter的液體試劑進(jìn)行驗(yàn)證，并在驗(yàn)證完成后，作者將該方案定制成干粉形式，由于干粉產(chǎn)品相比較液體試劑，不僅可室溫保存，并且保存時間更久，同時還可以減少實(shí)驗(yàn)操作，樣本間一致性也更高等優(yōu)點(diǎn)，便于日常診斷工作并最 大限度地減少差異。

貝克曼庫爾特公司不僅可以提供Duraclone干粉成品試劑，還可以提供客戶定制CDS，可以根據(jù)客戶需求，個性化組合定制干粉方案。相比較液體方案來說，定制化的干粉組合方案，不僅有液體單抗方案的自由組合的優(yōu)點(diǎn)，而且還有干粉試劑的優(yōu)點(diǎn)。

03.方案圈門策略

該方案用貝克曼庫爾特公司的Navios 3激光10色儀器進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集，并使用Kaluza軟件進(jìn)行分析。

3.1  對CD45+ 白細(xì)胞進(jìn)行圈門；

3.2  對CD3+ T 細(xì)胞和CD3- 細(xì)胞進(jìn)行圈門；

3.3  對CD3-內(nèi)的譜系陰性 (Lin-) 細(xì)胞進(jìn)行圈門；對CD14+ 單核細(xì)胞進(jìn)行圈門；對由 CD14 和 CD16 表達(dá)定義的單核細(xì)胞亞群進(jìn)行圈門；

3.4  對CD3+ T 細(xì)胞內(nèi)的CD4+ 和 CD8+ T細(xì)胞進(jìn)行圈門；對CD4+ 記憶T細(xì)胞亞群進(jìn)行圈門；圈門CD279+ CD8+ T細(xì)胞。

04.檢測性能驗(yàn)證

文章作者將此方案與貝克曼庫爾特公司的DURAClone IM T 細(xì)胞亞群管 和 DURAClone IM Basic管平行分析了來自 83 名患有II、III 或 IV期疾病的黑色素瘤患者的樣本，其中II 期(n = 52)、III期(n = 11) 或IV期(n = 20)。除CD14+ 單核細(xì)胞外，其他參數(shù)均觀察到方法之間的強(qiáng)相關(guān)性，CD14+ 單核細(xì)胞顯示出中等相關(guān)性。

DURAClone IM Basic和DURAClone IM T是貝克曼庫爾特公司的Duraclone IM全套抗體組合方案中的第1管與第3管。該產(chǎn)品的優(yōu)點(diǎn)是干粉，保存的時間比液體更久；而且預(yù)混抗體也能節(jié)省實(shí)驗(yàn)時間，相比于自己混勻抗體后分裝染色，樣本間的一致性會更高。產(chǎn)品質(zhì)量滿足ISO 9001認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)（ISO 9001-2008）。

文章作者之前確立了一個cutoff值≥16% CD4+ TEM 細(xì)胞作為 CMV Ig+ 患者檢查點(diǎn)阻斷相關(guān)肝炎的預(yù)測因子。因此在將患者分類為 CD4+ TEM ≥16% 或 CD4+ TEM <16% 時，DURAClone IM T 細(xì)胞亞群管和 MoT測試管結(jié)果在 81/83 例 (98%) 中一致。此外，E圖顯示在確定 CMV 血清學(xué)狀態(tài)，并在治 療開始后 12 周內(nèi)評估免疫相關(guān)肝炎的發(fā)展。紅色虛線表示 CD4+ TEM ≥ 16% 的cutoff值， 中值用黑線表示，MoT 方案在預(yù)測 16 名 IV 期黑色素瘤患者的肝炎方面表現(xiàn)良好。F圖顯示6 名 CMV IgG+ CD4+ TEM ≥16% 黑色素瘤患者中有 5 名正確預(yù)測了肝炎。

經(jīng)過驗(yàn)證，文章作者用cutoff值≥16% CD4+ TEM 細(xì)胞作為 CMV Ig+ 患者檢查點(diǎn)阻斷相關(guān)肝炎的預(yù)測因子，相關(guān)的PPV=83%，NPV=80%。

另外，文章作者還從批內(nèi)精密度、批間精密度、操作者間分析精度、樣本穩(wěn)定性、樣本染色穩(wěn)定性、年齡、性別和疾病相關(guān)偏倚、季節(jié)性等方面進(jìn)行了驗(yàn)證，確保該方案結(jié)果是在可接受范圍內(nèi)的，由于篇幅的關(guān)系，就不一一列出來了，感興趣的讀者可以去原文查看，其詳細(xì)的介紹了作者驗(yàn)證思路與結(jié)果。

術(shù)中光學(xué)相干斷層掃描（OCT）輔助下Leber先天性黑矇（LCA）黃斑修復(fù)術(shù)

病例研究的內(nèi)容

Leber先天性黑矇（LCA）是一組先天性視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良，可導(dǎo)致早年出現(xiàn)重度視力損傷?；颊咄ǔ１憩F(xiàn)為眼球震顫、瞳孔反應(yīng)遲鈍或近乎缺失、視力嚴(yán)重下降、畏光和高度遠(yuǎn)視[1]。眼部基因治 療可極大改善這些患者的視力[2]。通過術(shù)中視網(wǎng)膜下注射AAV載體完成基因傳遞。

視網(wǎng)膜下眼部基因治 療注射對準(zhǔn)確度水平有較高要求。因此，術(shù)中光學(xué)相干斷層掃描（OCT）是一項(xiàng)必不可少的工具。術(shù)中OCT可向眼科醫(yī)生提供實(shí)時信息，支持氣泡管理，并可用于確認(rèn)預(yù)期的載體量是否到達(dá)視網(wǎng)膜下間隙。術(shù)中OCT還有助于預(yù)防并發(fā)癥，例如載體注射期間術(shù)中形成的黃斑裂孔。

病例研究中值得期待的內(nèi)容

學(xué)習(xí)要點(diǎn)

• 了解21歲視網(wǎng)膜變性及2型Leber先天性黑矇（LCA）患者的手術(shù)治 療

• 發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜下眼部基因治 療注射的不同步驟

• 理解術(shù)中OCT在黃斑修復(fù)術(shù)中的作用

眼部基因治 療病例描述

1例21歲西班牙裔女性，自出生以來視力不良，包括夜盲癥、視野收縮、視力下降和色覺下降?；颊咦⒁獾匠霈F(xiàn)緩慢的進(jìn)行性功能性退減。盡管已完成高中學(xué)業(yè)，但她的方向感日益惡化，并且由于視力限制無法獨(dú)立生活和工作。

圖1：圖注：黃斑OCT和超寬視野眼底圖像顯示基線色素性視網(wǎng)膜病變和相對保留中央凹的感光器改變。圖像由A博士提供

診斷與術(shù)前評估

雙眼術(shù)前視力均為20/150?；颊弑憩F(xiàn)為典型彌散性視網(wǎng)膜變性，黃斑相對保留?；驒z測顯示雙等位基因RPE65變異導(dǎo)致視網(wǎng)膜變性，并提示2型Leber先天性黑矇。鑒于可獲得視網(wǎng)膜活細(xì)胞且考慮到眼部基因治 療的潛在受益，對雙眼進(jìn)行了視網(wǎng)膜下注射治 療。兩次手術(shù)之間間隔兩周。黃斑OCT和超寬視野眼底圖像顯示基線色素性視網(wǎng)膜病變和相對保留中央凹的感光器改變。

圖2：進(jìn)行黃斑掃描以記錄注射前解剖結(jié)構(gòu)，圖像由A博士提供

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術(shù)中OCT提高視網(wǎng)膜下基因增強(qiáng)治 療的手術(shù)安全性和治 療準(zhǔn)確性

基因增強(qiáng)治 療是一種眼部基因轉(zhuǎn)移方法，用于治 療當(dāng)功能蛋白不足表現(xiàn)為遺傳病時的常染色體隱性或X性染色體連鎖視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良。這些基因缺陷引發(fā)特定視力障礙和/或視網(wǎng)膜變性。

近期，基因治 療在視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良中的應(yīng)用引發(fā)了人們巨大的興趣。視網(wǎng)膜下基因治 療藥物注射術(shù)的技術(shù)要求較高，具有一定難度。術(shù)中光學(xué)相干斷層掃描（術(shù)中OCT）可提供實(shí)時信息并向外科醫(yī)生提供反饋，包括對眼后段結(jié)構(gòu)的滲透深度、注射液的分布和傳播、載體回流以及術(shù)中黃斑中心凹的完整性。

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