CRISPR-Cas9技術(shù)徹底改變了基礎(chǔ)生物研究和應(yīng)用生物技術(shù)的許多領(lǐng)域。但在臨床基因治療實(shí)施中脫靶效應(yīng)的檢測(cè)仍然存在難題。德國(guó)漢堡大學(xué)-艾本多夫醫(yī)學(xué)中心（UKE）干細(xì)胞移植、細(xì)胞和基因治療研究所的學(xué)者們近日在知名雜志《Molecular Therapy》上發(fā)表“LATE–a novel sensitive cell-based assay for the study of CRISPR/Cas9-related long-term adverse treatment effects”的文章，建立了稱(chēng)為L(zhǎng)ATE（長(zhǎng)期不良治療效果鑒定檢測(cè)）的新型檢測(cè)方法，該方法使用Stilla naica?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)檢測(cè)低頻的脫靶事件，且有助于分析Cas9脫靶切割效應(yīng)的影響，并可在單細(xì)胞層面進(jìn)行評(píng)估。

為了證明LATE方法有助于檢測(cè)Cas9脫靶切割后的功能影響，研究人員進(jìn)行了小規(guī)模的原理驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：明星基因TP53基因敲除后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞表現(xiàn)出相對(duì)生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，這是主要的致瘤性標(biāo)志之一，因此可以作為驗(yàn)證“LATE”檢測(cè)脫靶能力的指示。本文選取TP53進(jìn)行CRISPR靶向?qū)嶒?yàn)，并轉(zhuǎn)染到有限稀釋后的原代人類(lèi)新生兒包皮成纖維NUFF細(xì)胞中，通過(guò)“LATE”方法重復(fù)檢測(cè)到低頻(<0.5%)生長(zhǎng)促進(jìn)事件，這一結(jié)果證明了即使在低起始細(xì)胞數(shù)的情況下，LATE檢測(cè)也具有高靈敏度，并且可以對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行評(píng)估。

圖 1. LATE檢測(cè)原理

LATE檢測(cè)的原理包括 (1)用編碼熒光蛋白、設(shè)計(jì)的核酸酶(Cas9)和gRNA的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)原代人類(lèi)新生兒包皮成纖維細(xì)胞 (NUFF)，(2) 使用流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)導(dǎo)率并連續(xù)監(jiān)控長(zhǎng)達(dá)10周，(3)讀取結(jié)果，隨著轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞數(shù)量的增加，作為基因組編輯效應(yīng)的細(xì)胞獲得生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)

在這一過(guò)程中，“LATE”讀取到的陽(yáng)性結(jié)果（獲得生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的細(xì)胞）會(huì)不會(huì)由TP53以外的基因被“脫靶敲除”引起，或者是序列存在其他的突變，例如插入誘變從而導(dǎo)致細(xì)胞獲得生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)呢?為了研究“LATE”檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)果與TP53插入缺失之間的聯(lián)系，研究人員設(shè)計(jì)了GEF-dPCR（gene-editing frequency digital PCR）實(shí)驗(yàn)，即Drop-Off分析方法，該方法可以量化gRNA結(jié)合位點(diǎn)以及脫靶位點(diǎn)的插入缺失頻率。

圖2. NUFF細(xì)胞獲得的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)與TP53中的插入/缺失頻率相關(guān) (A)TP53外顯子4片段和GEF-dPCR中使用的FAM、HEX標(biāo)記探針的示意圖。(B) TP53插入/缺失頻率，數(shù)據(jù)由GFR-dPCR測(cè)量獲得。(C) 脫靶TP53插入/缺失頻率，由GEF-dPCR測(cè)量獲得。

對(duì)于TP53 gRNA結(jié)合位點(diǎn)的檢測(cè)，GEF-dPCR使用兩個(gè)雙標(biāo)記水解探針，一個(gè)HEX標(biāo)記探針與遠(yuǎn)離gRNA識(shí)別序列的區(qū)域結(jié)合，易發(fā)生插入缺失的位點(diǎn)設(shè)計(jì)FAM標(biāo)記的探針（圖2A）。

文中使用Stilla naica?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)進(jìn)行GFR-dPCR方法檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)方法詳見(jiàn)原文第12頁(yè)。

隨后進(jìn)行Stilla naica?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)檢測(cè)，結(jié)果顯示隨著時(shí)間的推移，TP53插入缺失的頻率隨之增加，轉(zhuǎn)導(dǎo)后第7天插入缺失率為1%–22%，在52天后達(dá)到44%–85%的峰值，該變化趨勢(shì)和細(xì)胞獲得生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的趨勢(shì)一致。（圖2B）

研究人員還對(duì)TP53脫靶位點(diǎn)的插入缺失頻率進(jìn)行了檢測(cè)（圖2C）。上述dPCR檢測(cè)結(jié)果也與NGS測(cè)序方法和RGB熒光標(biāo)記方法一致，從而說(shuō)明“LATE”能夠檢測(cè)TP53介導(dǎo)的gRNA的不良脫靶效應(yīng)，但這些gRNA并沒(méi)有被常用的在線預(yù)測(cè)工具標(biāo)記為“危險(xiǎn)信號(hào)”。

隨后，作者還驗(yàn)證了“LATE”可用于任何類(lèi)型的設(shè)計(jì)核酸酶以及不同的CRISPR/Cas變體，并且可以擴(kuò)展用于其他細(xì)胞類(lèi)型，尤其是高度相關(guān)的原代hMSC。因此，“LATE”實(shí)驗(yàn)方案可用于驗(yàn)證特定細(xì)胞類(lèi)型中特定設(shè)計(jì)核酸酶的脫靶效應(yīng)的影響。

圖3：LATE檢測(cè)可應(yīng)用于hMSCs和h-TERT永生化細(xì)胞

綜上，“LATE”可以作為一種簡(jiǎn)單、快速和經(jīng)濟(jì)的技術(shù)手段，用來(lái)評(píng)估CRISPR/Cas系統(tǒng)帶來(lái)的生理“副作用”影響，輔助臨床前的安全性研究，是對(duì)基于NGS的全基因組脫靶檢測(cè)方法的有效補(bǔ)充，特別是補(bǔ)充了流式和數(shù)字PCR的檢測(cè)結(jié)果。

期刊介紹：《Molecular Therapy》是美國(guó)基因治療學(xué)會(huì)(ASGT)的月刊，是基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、載體開(kāi)發(fā)與設(shè)計(jì)、干細(xì)胞制造、基因、肽、蛋白、寡核苷酸的開(kāi)發(fā)、細(xì)胞療法、疫苗開(kāi)發(fā)、臨床前目標(biāo)驗(yàn)證、安全性/有效性研究和臨床試驗(yàn)等領(lǐng)域的領(lǐng)先期刊?！禡olecular Therapy》致力于促進(jìn)遺傳學(xué)、醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)的科學(xué)發(fā)展，影響因子為6.698。

11月19日北京時(shí)間23:00（巴黎時(shí)間：17:00），歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室研究員Moritz Kueblbeck將于Genomeweb平臺(tái)在線分享“在CRISPR編輯的細(xì)胞系中使用數(shù)字PCR進(jìn)行標(biāo)記拷貝數(shù)評(píng)估”相關(guān)知識(shí)。

本網(wǎng)絡(luò)研討會(huì)將介紹如何使用dPCR快速定量CRISPR編輯的HeLa細(xì)胞中的綠色熒光蛋白拷貝數(shù)。討論還將介紹dPCR的工作原理和采集后的數(shù)據(jù)分析方法。

Moritz Kueblbeck在德國(guó)海德堡的癌癥研究ZX(DKFZ)做了八年的研究員。2014年,他加入了Jan Ellenberg在海德堡的歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,在不同實(shí)驗(yàn)室的項(xiàng)目中，他使用CRISPR/Cas9方法利用內(nèi)源性的標(biāo)記蛋白(在HeLa和U-2 OS細(xì)胞進(jìn)行不同標(biāo)簽的純合敲入)進(jìn)行人類(lèi)細(xì)胞系基因組編輯。

內(nèi)容簡(jiǎn)介

l  熒光蛋白或自標(biāo)記是使用熒光顯微鏡研究活細(xì)胞中蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)的寶貴工具。然而，定量成像需要目標(biāo)蛋白(POI)的生理表達(dá)水平，特別是當(dāng)需要研究POI的化學(xué)計(jì)量相互作用時(shí)。

l  CRISPR使研究人員能夠標(biāo)記幾乎任何感興趣的目標(biāo)基因，使其可以研究相應(yīng)POI的生理表達(dá)水平。然而，正確編輯細(xì)胞克隆的產(chǎn)生和選擇——即標(biāo)記等位基因的預(yù)期數(shù)量和缺乏額外的整合——需要對(duì)標(biāo)記的拷貝數(shù)進(jìn)行定量評(píng)估。

l  探討dPCR是一種快速、可靠的熒光標(biāo)記CRISPR編輯細(xì)胞定量檢測(cè)方法。

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基因工程細(xì)胞的同質(zhì)性對(duì)于很多應(yīng)用都是必要條件，例如細(xì)胞株開(kāi)發(fā)、基因ZL、組織工程以及細(xì)胞ZL與再生醫(yī)學(xué)。CRISPR/Cas9基因編輯存在脫靶等情況，無(wú)法直接得到均質(zhì)的細(xì)胞，因此需要開(kāi)展單細(xì)胞克隆，之后才能用于臨床。

CloneSelect單細(xì)胞分離系統(tǒng)（CloneSelect Single Cell Printer）采用類(lèi)似噴墨打印的技術(shù)，柔和地產(chǎn)生包裹細(xì)胞的液滴無(wú)接觸地直接分配到微孔板中（圖1）。同時(shí)，該系統(tǒng)借助智能圖像分析，確認(rèn)細(xì)胞數(shù)目，分析細(xì)胞的形態(tài)（大小和圓度）及熒光強(qiáng)度，聯(lián)動(dòng)的真空裝置將不符合要求的液滴（如空液滴或者含多個(gè)細(xì)胞的液滴）直接吸走，而符合要求的細(xì)胞液滴則分配至微孔板，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)細(xì)胞的分選和接種。單細(xì)胞分離系統(tǒng)是一種可比移液器操作的柔和的單細(xì)胞分離技術(shù)，而流式分選由于高的液體剪切力和電壓的影響，會(huì)降低敏感細(xì)胞和部分受損細(xì)胞（如電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞）的成克隆率，因此單細(xì)胞分離系統(tǒng)更適用于基因工程細(xì)胞的克隆，維持細(xì)胞活力，并提供直接的單克隆性圖像證據(jù)。

圖1：CloneSelect f.sight單細(xì)胞分離系統(tǒng)

最近發(fā)表的一篇文章（Characterization of CRISPR/Cas9 RANKL knockout mesenchymal stem cell clones based on single-cell printing technology and emulsion coupling assay as a low-cellularity workflow for single-cell cloning），作者用CRISPR/Cas9對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）開(kāi)展RANKL基因敲除以提高其骨骼形成能力。整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程起始于轉(zhuǎn)染，接著用CloneSelect f.sight單細(xì)胞分離系統(tǒng)開(kāi)展單細(xì)胞克隆，隨后在DNA、RNA以及蛋白質(zhì)水平開(kāi)展分析，ZH開(kāi)展細(xì)胞功能分析（圖2）。

圖2：基因編輯間充質(zhì)干細(xì)胞的單細(xì)胞克隆及分析流程。（圖片來(lái)源：文獻(xiàn)1）。

作者在CRISPR/Cas9基因敲除質(zhì)粒中加入了GFP基因，轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞后，用具備熒光分選功能的CloneSelect f.sight系統(tǒng)分選出轉(zhuǎn)染成功的單細(xì)胞。系統(tǒng)可設(shè)定細(xì)胞直徑、圓度和熒光強(qiáng)度等指標(biāo)，分選出單個(gè)活細(xì)胞并接種至微孔板。圖3為系統(tǒng)分選基因編輯的間充質(zhì)干細(xì)胞的5張連續(xù)的圖像。通過(guò)瀏覽單細(xì)胞分離過(guò)程中記錄的5張連續(xù)的圖像，作者統(tǒng)計(jì)單細(xì)胞接種的成功率為93.9±2.7%（n=451），即僅有~6%的孔為多細(xì)胞孔，或空孔或無(wú)法確認(rèn)（圖4）。這一結(jié)果表明f.sight單細(xì)胞分離系統(tǒng)可以準(zhǔn)確地識(shí)別細(xì)胞并成功將其接種至微孔內(nèi)。

圖3：CloneSelect f.sight系統(tǒng)分選間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)采集的5張連續(xù)圖像，可用于證明單克隆性。（圖片來(lái)源：文獻(xiàn)¹）。

除了帶GFP的基因敲除質(zhì)粒外，作者還將pmaxGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至間充質(zhì)干細(xì)胞作為對(duì)照用于評(píng)估單細(xì)胞分離效率和克隆率。此外，作者轉(zhuǎn)染了多個(gè)不同的基因敲除質(zhì)粒。雖然不同的質(zhì)粒因?yàn)榇笮〔煌尸F(xiàn)各異的轉(zhuǎn)染效率，但是成克隆率都達(dá)到了30%。此外，作者還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的間充質(zhì)干細(xì)胞（31.3±8%）和未轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞（39.6±15.6%）在成克隆率上差異較小，這也表明f.sight的單細(xì)胞分選過(guò)程柔和，因此產(chǎn)生的系統(tǒng)偏差較?。▓D4）。

圖4：CloneSelect f.sight單細(xì)胞分離系統(tǒng)的高接種效率（左）和高成克隆率（右）。（圖片來(lái)源：文獻(xiàn)¹）。

接著作者采用surveyor assay、RT-PCR和emulsion coupling分別從DNA、RNA和蛋白質(zhì)水平對(duì)基因編輯后的間充質(zhì)單細(xì)胞開(kāi)展分析。ZH作者選出一株雙等位基因敲除的間充質(zhì)干細(xì)胞（g23d）檢測(cè)其成骨分化的能力，并以未編輯的MSC為對(duì)照開(kāi)展平行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)移到成骨分化培養(yǎng)基后，分別在第7天、14天和21天用茜素紅染色。在第14天，細(xì)胞失去細(xì)長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，開(kāi)始呈現(xiàn)出成骨細(xì)胞樣的形態(tài)，然后在第21天開(kāi)始出現(xiàn)鈣沉積，發(fā)展過(guò)程與親本的MSC對(duì)照類(lèi)似（圖5）。這表明基因編輯后的MSC其成骨分化能力并沒(méi)有因?yàn)榛蚓庉嫼秃Y選過(guò)程而受到影響。

圖5：RANKL基因敲除的間充質(zhì)干細(xì)胞（g23d）和親本間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)和成骨分化。（圖片來(lái)源：文獻(xiàn)1）。

在這個(gè)研究中，作者搭建了一整套實(shí)驗(yàn)流程，起始于CRISPR/Cas9基因編輯，單細(xì)胞克隆以及DNA、RNA和蛋白質(zhì)各個(gè)水平的分析和細(xì)胞功能測(cè)試。實(shí)驗(yàn)流程中采用CloneSelect f.sight單細(xì)胞分離系統(tǒng)成功GX地分選出基因編輯后帶GFP的間充質(zhì)干細(xì)胞。單細(xì)胞接種效率高達(dá)93.9% (± 2.7%)，且成克隆率高達(dá)31.3% (±8%)。相比傳統(tǒng)的有限稀釋法和流式分選，CloneSelect單細(xì)胞分離系統(tǒng)具有GX率，高活率，操作簡(jiǎn)單，單克隆性證據(jù)充分等優(yōu)勢(shì)，是基因工程細(xì)胞克隆的理想工具。

【數(shù)字PCR網(wǎng)絡(luò)研討會(huì)】

在CRISPR編輯的細(xì)胞系中

使用數(shù)字PCR進(jìn)行標(biāo)記拷貝數(shù)評(píng)估

       11月19日北京時(shí)間23:00（巴黎時(shí)間：17:00），歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室研究員Moritz Kueblbeck將于Genomeweb平臺(tái)在線分享“在CRISPR編輯的細(xì)胞系中使用數(shù)字PCR進(jìn)行標(biāo)記拷貝數(shù)評(píng)估”相關(guān)知識(shí)。

本網(wǎng)絡(luò)研討會(huì)將介紹如何使用dPCR快速定量CRISPR編輯的HeLa細(xì)胞中的綠色熒光蛋白拷貝數(shù)。討論還將介紹dPCR的工作原理和采集后的數(shù)據(jù)分析方法。

Moritz Kueblbeck在德國(guó)海德堡的癌癥研究ZX(DKFZ)做了八年的研究技術(shù)員。2014年,他加入了Jan Ellenberg在海德堡的歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,在不同實(shí)驗(yàn)室的項(xiàng)目中，他使用CRISPR/Cas9方法利用內(nèi)源性的標(biāo)記蛋白(在HeLa和U-2 OS細(xì)胞進(jìn)行不同標(biāo)簽的純合敲入)進(jìn)行人類(lèi)細(xì)胞系基因組編輯。

內(nèi)容簡(jiǎn)介

l  熒光蛋白或自標(biāo)記是使用熒光顯微鏡研究活細(xì)胞中蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)的寶貴工具。然而，定量成像需要目標(biāo)蛋白(POI)的生理表達(dá)水平，特別是當(dāng)需要研究POI的化學(xué)計(jì)量相互作用時(shí)。

l  CRISPR使研究人員能夠標(biāo)記幾乎任何感興趣的目標(biāo)基因，使其可以研究相應(yīng)POI的生理表達(dá)水平。然而，正確編輯細(xì)胞克隆的產(chǎn)生和選擇——即標(biāo)記等位基因的預(yù)期數(shù)量和缺乏額外的整合——需要對(duì)標(biāo)記的拷貝數(shù)進(jìn)行定量評(píng)估。

l  探討dPCR是一種快速、可靠的熒光標(biāo)記CRISPR編輯細(xì)胞定量檢測(cè)方法。

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數(shù)字PCR技術(shù)自1999年提出概念，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)核酸拷貝數(shù)濃度的JD定量的技術(shù)突破，為核酸JZ定量和基因檢測(cè)提供了全新的思路。

數(shù)字PCR技術(shù)具備無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)品、高JZ度、高靈敏度、高分辨力、多通道等技術(shù)特點(diǎn)，目前廣泛應(yīng)用于前沿生命科學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域，如先進(jìn)的基因/細(xì)胞ZL、干細(xì)胞移植、病原微生物定量、腫瘤個(gè)體化診療/液體活檢等多個(gè)前沿領(lǐng)域，為生命科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、藥物開(kāi)發(fā)、計(jì)量科學(xué)等科學(xué)家探索更高靈敏度、更JZ測(cè)量，提供了全新的路線和工具。

為更好地讓廣大學(xué)者了解數(shù)字PCR技術(shù)，快速完成qPCR方法到數(shù)字PCR方法的轉(zhuǎn)化，Gene-π數(shù)字PCR學(xué)堂——核酸JD定量分析及高階多重?cái)?shù)字PCR應(yīng)用訓(xùn)練營(yíng)（西湖大學(xué)站）將于2021年07月19日在杭州召開(kāi)。聚焦于數(shù)字PCR原理、實(shí)驗(yàn)操作、應(yīng)用進(jìn)展、結(jié)果分析、高階多重dPCR實(shí)驗(yàn)方案、生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域中數(shù)字PCR技術(shù)的方法及應(yīng)用等核心內(nèi)容，訓(xùn)練營(yíng)將攜ZS技術(shù)專(zhuān)家，為廣大學(xué)員帶來(lái)從理論到實(shí)戰(zhàn)、從入門(mén)到精通的饕餮盛宴。

培訓(xùn)時(shí)間地點(diǎn)

時(shí)間：2021年07月19日

地點(diǎn)：浙江杭州西湖大學(xué)-云棲校區(qū)--3號(hào)樓312會(huì)議室

培訓(xùn)日程

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您在PCR實(shí)驗(yàn)操作中是否遇到過(guò)問(wèn)題？如何在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中設(shè)置質(zhì)控要求？在什么濃度范圍內(nèi)檢測(cè)是準(zhǔn)確的？數(shù)字PCR的ZD檢測(cè)限如何評(píng)估？數(shù)字PCR引物探針設(shè)計(jì)和qPCR有什么區(qū)別及如何評(píng)估其質(zhì)量？在本次訓(xùn)練營(yíng)中都可以得到答案，心動(dòng)了嗎？心動(dòng)了就趕緊報(bào)名吧！場(chǎng)地有限，報(bào)名從速哦?？梢酝ㄟ^(guò)掃描下方二維碼進(jìn)行報(bào)名哦！

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一篇在線發(fā)表于《細(xì)胞》雜志的論文介紹了一項(xiàng)重要突破：來(lái)自韓國(guó)的研究團(tuán)隊(duì)***在線粒體DNA中實(shí)現(xiàn)A堿基到G堿基的轉(zhuǎn)換，為基因編輯技術(shù)填補(bǔ)上一塊***關(guān)重要的拼圖，也帶來(lái)了治愈多種線粒體遺傳病的希望。

從上世紀(jì)60年代***發(fā)現(xiàn)***性?xún)?nèi)切酶，到1985年發(fā)明PCR技術(shù)，再到***近十年CRISPR技術(shù)誕生、用于活體生物的基因編輯，短短半個(gè)世紀(jì)，人類(lèi)在一次又一次的突破中實(shí)現(xiàn)了操縱DNA能力的巨大飛躍。其中，CRISPR的出現(xiàn)更是讓科學(xué)家能高效編輯基因組中的致病突變，為眾多遺傳病提供全新的方案。

不過(guò)，還有一朵烏云長(zhǎng)期籠罩在基因編輯領(lǐng)域的上空，這就是線粒體DNA的編輯。

作為參與能量代謝的重要細(xì)胞器，線粒體中也含有少量來(lái)自母系的DNA。如果這部分基因發(fā)生突變，則可能導(dǎo)致多種與代謝相關(guān)的遺傳疾病。

例如，Leber遺傳性視神經(jīng)病變（LHON）可能導(dǎo)致患者失明，這種兇險(xiǎn)的疾病就是由線粒體DNA的點(diǎn)突變導(dǎo)致的。線粒體DNA突變還可能導(dǎo)致某些線粒體腦肌病，患者的大腦遭受損傷，可能出現(xiàn)癲癇、精神行為異常等癥狀。平均每5000個(gè)人里，就有一個(gè)人患上線粒體點(diǎn)突變導(dǎo)致的遺傳病。

盡管基因編輯工具***近十年迎來(lái)爆發(fā)式發(fā)展，但面對(duì)線粒體遺傳病時(shí)，這些工具卻總是難以奏效。例如，當(dāng)下***為盛行的CRISPR-Cas系統(tǒng)就因?yàn)橄驅(qū)NA不能穿越線粒體膜，因而無(wú)法用于線粒體疾病。

線粒體DNA的編輯，可以說(shuō)是基因編輯領(lǐng)域***后一塊未經(jīng)涉足的土地，而這個(gè)難題也成為治愈多種遺傳疾病必須跨越的障礙。

2020年，一項(xiàng)***性的突破到來(lái)。Broad研究所的劉如謙教授團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一款名為DdCBE的基因編輯工具，可以直接修改雙鏈DNA上的堿基，實(shí)現(xiàn)從C堿基到T堿基的轉(zhuǎn)換，這也是科學(xué)家***在人體細(xì)胞中進(jìn)行線粒體DNA的編輯。

不過(guò)，作為線粒體DNA編輯的開(kāi)拓性成果，DaCBE也有不足之處：其只能高效地進(jìn)行TC-TT序列的轉(zhuǎn)換，在90個(gè)已知的致病線粒體突變位點(diǎn)中，只有9個(gè)能得到修復(fù)。

而在這90個(gè)突變位點(diǎn)中，有多達(dá)39個(gè)都可以通過(guò)A-G堿基的轉(zhuǎn)換來(lái)修復(fù)。如果能找到實(shí)現(xiàn)A-G轉(zhuǎn)換的手段，那么包括上述兩種疾病在內(nèi)，多種線粒體遺傳病都有望迎來(lái)治愈的方法。

在這項(xiàng)發(fā)表于《細(xì)胞》的***新研究中，來(lái)自韓國(guó)基礎(chǔ)科學(xué)研究所基因編輯中心的研究團(tuán)隊(duì)終于完成了這項(xiàng)“不可能的任務(wù)”，他們開(kāi)發(fā)出一款全新的基因編輯平臺(tái)，命名為轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物相關(guān)脫氫酶（transcription activator-like effector-linked deaminases，簡(jiǎn)稱(chēng)TALED）。

▲TALED編輯線粒體DNA的示意圖

論文***作者CHO Sung-Ik表示：“我們?cè)O(shè)計(jì)的新型堿基編輯器極大地拓展了線粒體DNA編輯的范圍，這不僅有助于構(gòu)建疾病模型，還將幫助人們開(kāi)發(fā)新療法。”

TALED到底是什么？接下來(lái)我們將看到，TALED由3個(gè)功能各異的主要部分組成，它們環(huán)環(huán)相扣、共同協(xié)作，***終完成這項(xiàng)基因編輯任務(wù)。

***個(gè)部分，可以看作TALED的向?qū)?。前面說(shuō)到，常見(jiàn)的基因編輯系統(tǒng)無(wú)法進(jìn)入線粒體。為了解決這個(gè)問(wèn)題，TALED與劉如謙團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的DaCBE一樣，使用了轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物（TALE）。作為一種DNA結(jié)合蛋白，TALE蛋白能夠靶向特異的DNA序列，其在線粒體靶向序列（MTS）的引導(dǎo)下進(jìn)入線粒體，并且與特定的線粒體DNA序列結(jié)合。

到這里，TALED就被帶到了工作場(chǎng)所。在這里，輪到TALED的第二個(gè)部分登場(chǎng)。研究團(tuán)隊(duì)需要找到合適的脫氫酶，在這里實(shí)現(xiàn)A-G堿基的轉(zhuǎn)換。為此，他們選擇是名為T(mén)adA8e的腺嘌呤脫氫酶，其由大腸桿菌的腺嘌呤脫氫酶改造而來(lái)。

這個(gè)選擇頗具創(chuàng)意，因?yàn)門(mén)adA8e被認(rèn)為是一種專(zhuān)門(mén)對(duì)單鏈DNA起作用的蛋白，但在這里，它需要在線粒體的雙鏈DNA中進(jìn)行堿基編輯。

這篇論文的通訊作者，基因編輯中心主任KIM Jin-Soo教授說(shuō)：“沒(méi)有人想過(guò)用TadA8e在線粒體中進(jìn)行堿基編輯，因?yàn)樗徽J(rèn)為只對(duì)單鏈DNA起作用。正是這個(gè)跳出傳統(tǒng)框架的想法，幫助我們發(fā)明了TALED。”

而幫助TadA8e做到這一點(diǎn)的，是TALED的***后一個(gè)主要部分：胞嘧啶脫氫酶DddAtox。DddAtox使得雙鏈DNA可以短暫地解開(kāi)，而TadA8e正是抓住了這個(gè)轉(zhuǎn)瞬即逝的時(shí)間窗口，在人類(lèi)細(xì)胞的線粒體中高效催化A-G堿基的轉(zhuǎn)換，編輯頻率可高達(dá)49%。

▲TALED實(shí)現(xiàn)了A-G堿基的轉(zhuǎn)換

通過(guò)對(duì)TALED的調(diào)整，研究團(tuán)隊(duì)分別開(kāi)發(fā)出能同時(shí)實(shí)現(xiàn)A-G以及C-T堿基轉(zhuǎn)換的技術(shù)，以及僅進(jìn)行A-G轉(zhuǎn)換的技術(shù)。

當(dāng)然，作為一項(xiàng)開(kāi)創(chuàng)性的技術(shù)，TALED仍有不***之處，例如在進(jìn)行堿基編輯時(shí)，可能會(huì)造成與目標(biāo)位點(diǎn)相鄰的核苷酸也發(fā)生轉(zhuǎn)換；此外，TALED是否會(huì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生脫靶效應(yīng)也有待觀察。

但毫無(wú)疑問(wèn)，TALED技術(shù)的出現(xiàn)讓我們又多了一種***潛力的基因編輯工具，展望這項(xiàng)技術(shù)的未來(lái)應(yīng)用場(chǎng)景，研究團(tuán)隊(duì)希望能提升TALED的編輯效率與特異性，***終能夠分別在胚胎、新生兒與成年患者體內(nèi)修正致病的線粒體突變。我們期待，那些受困于線粒體遺傳病的人們終將迎來(lái)治愈的一刻。

RNA提取磁珠屬于納米生物磁珠的一種，主要作用是用于核酸提取過(guò)程中的RNA提取，粒徑分布在500nm左右，是洛陽(yáng)吉恩特生物自主研發(fā)生產(chǎn)的高分子納米磁性微球，該磁珠懸浮時(shí)間長(zhǎng)，磁響應(yīng)時(shí)間迅速，對(duì)DNA甲基化過(guò)程中的提取環(huán)節(jié)提供良好的支持，可明顯縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率，并在提取結(jié)果上保持穩(wěn)定，配合核酸提取儀，更能實(shí)現(xiàn)快速的RNA提取。

基因編輯技術(shù)指能夠讓人類(lèi)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行“編輯”，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)，就有著其它基因編輯技術(shù)無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，技術(shù)不斷改進(jìn)后，更被認(rèn)為能夠在活細(xì)胞中最有效、最便捷地“編輯”任何基因。

但是在CRISPR基因編輯之后，工作并沒(méi)有結(jié)束，你需要驗(yàn)證感興趣的基因是否成功突變。想知道如何利用高靈敏度、高jingzhun度的數(shù)字PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)基因編輯嗎？快來(lái)參加本次深藍(lán)云直播課堂吧！

從1985年至今的30多年時(shí)間里，PCR分析經(jīng)歷了三代技術(shù)的發(fā)展。DY代傳統(tǒng)PCR技術(shù)，采用瓊脂糖凝膠電泳的方法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定性分析。第二代熒光定量PCR技術(shù)，通過(guò)在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR進(jìn)程，ZH用Cq值對(duì)基因進(jìn)行定量分析。第三代數(shù)字PCR技術(shù)，通過(guò)將PCR反應(yīng)液進(jìn)行有限稀釋?zhuān)瑢?shí)現(xiàn)核酸分子的單分子擴(kuò)增，ZZ采取終點(diǎn)法檢測(cè)陽(yáng)性微滴的熒光信號(hào)，有熒光信號(hào)的微滴判讀為 1；沒(méi)有熒光信號(hào)的微滴判讀為 0，因此該技術(shù)被稱(chēng)為數(shù)字PCR。

PCR技術(shù)在不斷地蛻變卻從未淡出我們的視野，如今已經(jīng)滲透到分子生物學(xué)領(lǐng)域的各種研究層面。尤其在今年大流行疾病中，展現(xiàn)了PCR技術(shù)的強(qiáng)大之處。那在科學(xué)研究中，我們?cè)撊绾芜x擇傳統(tǒng)PCR 、熒光定量 PCR與數(shù)字 PCR呢？

首先我們要清楚，三代PCR技術(shù)所有的基礎(chǔ)源于PCR反應(yīng)的基本原理和PCR反應(yīng)的3個(gè)重要階段，分別是指數(shù)期、線性期和平臺(tái)期。

指數(shù)期

指數(shù)期內(nèi)，每個(gè)循環(huán)PCR產(chǎn)物量大約增加1倍（假定 100%反應(yīng)效率），該階段的擴(kuò)增反應(yīng)具有高度特異性和精確度。

線性期（高變異性）

隨著PCR反應(yīng)體系成分的消耗，其中的一個(gè)或者多種成分限制反應(yīng)，導(dǎo)致反應(yīng)開(kāi)始減緩，并且每個(gè)循環(huán)的PCR 產(chǎn)物不再加倍。

平臺(tái)期

反應(yīng)停止，不再產(chǎn)生更多的產(chǎn)物。因?yàn)槊總€(gè)樣品具有不同的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，所以每個(gè)反應(yīng)將在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)入平臺(tái)期，平臺(tái)期內(nèi)可以看到這些差異。

傳統(tǒng) PCR

傳統(tǒng)PCR通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR終產(chǎn)物進(jìn)行分析（圖2），它的局限性就在于只能做定性分析。在圖3中，3個(gè)反應(yīng)孔含有相同量的 DNA模板，但到達(dá)平臺(tái)期后產(chǎn)生的熒光信號(hào)卻不同，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物的量存在不同（反應(yīng)動(dòng)力學(xué)變化所致）。這也表明了傳統(tǒng)PCR平臺(tái)期測(cè)量時(shí)結(jié)果存在變異，產(chǎn)出的DNA量不一定能反映最初情況，所以無(wú)法進(jìn)行定量。

熒光定量 PCR

同樣在圖3中，發(fā)現(xiàn)在指數(shù)期內(nèi)，3個(gè)反應(yīng)孔的擴(kuò)增曲線完全重合，說(shuō)明指數(shù)期內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)將更加精確，可實(shí)現(xiàn)更加準(zhǔn)確的定量。閾值線是擴(kuò)增產(chǎn)物熒光強(qiáng)度超過(guò)背景時(shí)的一個(gè)熒光強(qiáng)度值，樣品達(dá)到此熒光強(qiáng)度值所經(jīng)過(guò)的循環(huán)數(shù)稱(chēng)為Cq值。通過(guò)比較未知濃度的樣品與一系列標(biāo)準(zhǔn)品的Cq值，可以精確測(cè)定未知反應(yīng)中的模板 DNA數(shù)量。

數(shù)字 PCR

數(shù)字 PCR 是通過(guò)將樣本DNA隨機(jī)分布至獨(dú)立的反應(yīng)單元中，每個(gè)反應(yīng)單元中包含或者不包含1個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子，所有獨(dú)立的反應(yīng)單元進(jìn)行平行擴(kuò)增后，對(duì)每個(gè)反應(yīng)單元的陰性或者陽(yáng)性熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，就可以計(jì)算出原始樣本的拷貝數(shù)，無(wú)需參考標(biāo)準(zhǔn)品或內(nèi)源性對(duì)照品，也不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線。

傳統(tǒng)PCR 、熒光定量 PCR與數(shù)字 PCR的選擇

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Naica?微滴芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國(guó)Stilla Technologies Naica數(shù)字PCR平臺(tái)是實(shí)現(xiàn)高靈敏DNA/RNAJD定量的技術(shù)工具，只需一步移液操作，即可自動(dòng)生成單層平鋪的微滴，同一反應(yīng)液進(jìn)行多基因的單分子模板擴(kuò)增，通過(guò)三色或六色熒光通道檢測(cè)，自動(dòng)QC質(zhì)控，識(shí)別多色熒光中有效的陰陽(yáng)性微滴，從而達(dá)到目的DNA/RNA的高JZjuedui定量。同時(shí)提供原始數(shù)據(jù)、單微滴追溯等功能，確保數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。

參考文獻(xiàn)：

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導(dǎo)讀

在過(guò)去的幾十年中，糖尿病的發(fā)病率在顯著增長(zhǎng)。除了不健康的生活方式外，環(huán)境污染物被認(rèn)為是糖尿病發(fā)生的危險(xiǎn)因素。多環(huán)芳烴 (PAH)是一類(lèi)含有2-7個(gè)芳環(huán)的有機(jī)化合物，由自然和人類(lèi)活動(dòng)產(chǎn)生并廣泛存在的污染物。流行病學(xué)研究表明，PAHs水平與成人和兒童的肥胖和二型糖尿病相關(guān)。

廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞應(yīng)激生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的研究人員在Ecotoxicology and Environmental Safety上發(fā)表了題為《Prenatal exposure to a mixture of PAHs causes the dysfunction of islet cells in adult male mice: Association with type 1 diabetes mellitus》的文章。文中應(yīng)用naica?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對(duì)胰島素編碼基因DNA甲基化水平進(jìn)行量化，揭示了產(chǎn)前暴露于多環(huán)芳烴混合物對(duì)成年雄性小鼠胰島細(xì)胞功能的不良影響。

應(yīng)用亮點(diǎn)：

?  使用naica?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對(duì)胰島素編碼基因啟動(dòng)子甲基化水平進(jìn)行量化。

? 在產(chǎn)前暴露于500μg/kg PAHs的小鼠中，胰島素編碼基因啟動(dòng)子的甲基化水平顯著升高。

? 產(chǎn)前暴露于PAHs可能促進(jìn)I型糖尿病的發(fā)病。

作者使用8種PAHs的混合物進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，以研究產(chǎn)前PAHs對(duì)成年期胰島細(xì)胞功能和質(zhì)量的影響，同時(shí)試圖闡明 I型糖尿病發(fā)病的環(huán)境原因。他們分離了成年雄性小鼠的胰島，對(duì)胰島素編碼基因的啟動(dòng)子DNA甲基化水平進(jìn)行分析。

研究成果：

▲圖1. 產(chǎn)前暴露于多環(huán)芳烴對(duì)成年雄性小鼠胰島素編碼基因甲基化水平的影響。(A) 數(shù)字PCR結(jié)果代表性一維圖。(B)胰島素編碼基因啟動(dòng)子甲基化水平。(每個(gè)處理三只母鼠, 每只母鼠取一個(gè)雄性后代) 。

在本研究中，子宮內(nèi)暴露于500μg/kg PAHs的小鼠胰島中胰島素編碼基因啟動(dòng)子中的DNA甲基化水平顯著增加，同時(shí)胰島素編碼基因轉(zhuǎn)錄顯著下調(diào)。

▲圖2. 不同PAHs濃度對(duì)胰島素編碼基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

期刊介紹：

Ecotoxicology and Environmental Safety 1977創(chuàng)刊，隸屬于愛(ài)思唯爾出版集團(tuán)。是一份多學(xué)科交叉期刊，主要研究環(huán)境污染對(duì)包括人類(lèi)健康在內(nèi)的生物體的暴露和影響。最新影響因子為7.129。

naica?六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國(guó)Stilla Technologies公司naica?六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片式數(shù)字PCR技術(shù)，自動(dòng)化微滴生成和擴(kuò)增，每個(gè)樣本孔可實(shí)現(xiàn)6熒光通道的檢測(cè)，智能化識(shí)別微滴并進(jìn)行質(zhì)控，3小時(shí)內(nèi)即可獲得至少6個(gè)靶標(biāo)基因的絕對(duì)拷貝數(shù)濃度。

張覺(jué)超

新技術(shù)的誕生往往會(huì)為行業(yè)的發(fā)展做出一些貢獻(xiàn)。今天，我們通過(guò)解讀匹茲堡大學(xué)Cell DIVE^TM用戶(hù)在《Nature Communication》雜志上發(fā)表的題為“Spatial domain analysis predicts risk of colorectal cancer recurrence and infers associated tumor microenvironment networks”的研究論文[1]，感受一下徠卡Cell DIVE^TM給予結(jié)腸癌預(yù)后推斷方法革新的“推背力”。

研究背景

結(jié)直腸癌（Colorectal Cancer，CRC）是三大癌癥類(lèi)型之一，占癌癥相關(guān)死亡人數(shù)的第二位（圖1）[2]。雖然CRC患者采用成熟的TNM分型進(jìn)行分期和ZL，但腫瘤的異質(zhì)性導(dǎo)致相同分型結(jié)腸癌患者的預(yù)后大相徑庭。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，相當(dāng)比例的CRC患者術(shù)后1-2年出現(xiàn)癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，進(jìn)而生命健康受到危害[2]。而術(shù)后積極復(fù)查并進(jìn)行鞏固ZL則能夠避免結(jié)腸癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。隨著對(duì)CRC研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)CRC異質(zhì)性在腫瘤微環(huán)境中有所體現(xiàn)，并與患者預(yù)后存在相關(guān)性[3]。針對(duì)這一發(fā)現(xiàn)，人們利用腫瘤分子表型、腫瘤微環(huán)境組成和腫瘤內(nèi)T細(xì)胞浸潤(rùn)等指標(biāo)進(jìn)行結(jié)腸癌預(yù)后預(yù)測(cè)和判斷方法的建立[4]。近年來(lái)，已有一些結(jié)腸癌預(yù)后判斷的方法被提出（如Immunoscore?等）。但現(xiàn)有的預(yù)后推斷方法多基于傳統(tǒng)病理技術(shù)，被單次檢測(cè)標(biāo)記抗體的數(shù)量所限制，無(wú)法做到多指標(biāo)和空間信息兼顧的全面檢測(cè)，導(dǎo)致CRC預(yù)后推斷方法的開(kāi)發(fā)遭遇瓶頸。多重標(biāo)記免疫組化技術(shù)的發(fā)展幫助我們突破了這一限制。今天我們關(guān)注這篇文章的作者就是利用了徠卡Cell DIVE^TM超多標(biāo)組織成像分析技術(shù)實(shí)現(xiàn)了CRC預(yù)后推斷新方法——計(jì)算分析與系統(tǒng)生物學(xué)平臺(tái)（analytics computational and systems biology platform，SpAn平臺(tái)）的建立。

圖1 不同種類(lèi)癌癥新增病例和死亡比例統(tǒng)計(jì)圖（2018年）[2]

研究簡(jiǎn)述

文章的作者在Cell DIVE^TM開(kāi)發(fā)階段就關(guān)注了其前身技術(shù)（MultiOmyx技術(shù)）在CRC微環(huán)境檢測(cè)方面的潛力，并在Cell DIVE^TM上市后，優(yōu)先將其用于CRC預(yù)后推斷方法的開(kāi)發(fā)。在Cell DIVE^TM的幫助下，作者非常輕松的完成了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的抗體選擇環(huán)節(jié)。作者從Cell DIVE^TM認(rèn)證的400余種抗體的資源庫(kù)中選取了55個(gè)生物標(biāo)志物作為檢測(cè)目標(biāo)：其中包括常見(jiàn)的上皮、免疫和基質(zhì)細(xì)胞譜系及分類(lèi)標(biāo)記分子，還包括與CRC分型相關(guān)信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白、胞外運(yùn)輸和代謝相關(guān)的分子標(biāo)記、腫瘤抑 制能力相關(guān)的功能蛋白、癌基因相關(guān)的生物標(biāo)志、細(xì)胞粘附相關(guān)蛋白、細(xì)胞和基質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)的分子標(biāo)記、細(xì)胞類(lèi)型及其狀態(tài)相關(guān)的特征分子等。

圖2 結(jié)腸癌組織超多標(biāo)熒光組化成像（標(biāo)尺，100 μm）

隨后，作者利用Cell DIVE^TM成像儀對(duì)美國(guó)Clearview癌癥研究所收集到的432例TNM分期在I至III期CRC患者的組織微陣列樣本進(jìn)行超多標(biāo)熒光免疫組化成像（圖2），并利用Cell DIVE^TM配套分析軟件完成不同腫瘤區(qū)域的自動(dòng)識(shí)別（圖3）。根據(jù)組織結(jié)構(gòu)特異性標(biāo)記分子將腫瘤微環(huán)境分為上皮區(qū)域、間質(zhì)區(qū)域及上皮-間質(zhì)區(qū)域（上皮和間質(zhì)交界處100 μm的間質(zhì)和惡性上皮細(xì)胞相互作用緊密區(qū)域）。

圖3 結(jié)腸癌組織區(qū)域自動(dòng)識(shí)別及標(biāo)志物相關(guān)性分析

自動(dòng)分區(qū)完成后，作者展開(kāi)已檢測(cè)的55種標(biāo)志物的相關(guān)性分析，并通過(guò)遞歸運(yùn)算從中找出一系列預(yù)后判定標(biāo)志物（圖4）。

圖4 SpAn腫瘤微環(huán)境區(qū)域特異標(biāo)志物分析

接下來(lái)，作者通過(guò)人工智能學(xué)習(xí)把標(biāo)志分子表達(dá)模式和腫瘤微環(huán)境空間信息結(jié)合，開(kāi)發(fā)出CRC預(yù)后推斷運(yùn)算模型SpAn平臺(tái)，從而成功地將CRC患者分為術(shù)后高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)組和低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)組（圖5）。與以往的CRC預(yù)后推斷方法不同，SpAn平臺(tái)不需要額外輸入患者表型數(shù)據(jù)，可以完全根據(jù)腫瘤微環(huán)境的空間蛋白組學(xué)信息進(jìn)行預(yù)后推斷。

圖5 SpAn平臺(tái)5年CRC復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)生存曲線檢驗(yàn)

ZH，SpAn平臺(tái)與已有的CRC預(yù)后推斷方法對(duì)比表明，SpAn預(yù)測(cè)CRC患者5年復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的平均AUROC為88.5%（SE=0.1），顯著優(yōu)于目前的方法。相信在不遠(yuǎn)的將來(lái)，SpAn平臺(tái)能幫助YL工作者為CRC患者JZ地制定術(shù)后鞏固ZL方案。

Cell DIVE^TM “解密”

回顧SpAn平臺(tái)的建立，Cell DIVE^TM技術(shù)對(duì)組織微環(huán)境的超多標(biāo)成像和分析功不可沒(méi)。下面有請(qǐng)功臣“閃亮登場(chǎng)”：

Cell DIVE^TM超多標(biāo)組織成像分析整體解決方案，從上游的樣品制備，到染色成像，再到下游的數(shù)據(jù)分析，能夠提供一整套實(shí)驗(yàn)解決方案，突破傳統(tǒng)H&E染色、免疫組化和傳統(tǒng)免疫熒光10個(gè)biomarkers以?xún)?nèi)的限制，實(shí)現(xiàn)一張腫瘤組織切片上超過(guò)60個(gè)biomarkers的定性與定量分析，從單細(xì)胞水平的層面上，對(duì)腫瘤微環(huán)境進(jìn)行空間信息挖掘，助力腫瘤免疫ZL的研究。

當(dāng)然，如果您還想了解Cell DIVE^TM的更多優(yōu)點(diǎn)，敬請(qǐng)關(guān)注公眾號(hào)近期的相關(guān)文章。

參考文獻(xiàn)

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[主題]

    FluidFM：CRISPR基因編輯技術(shù)的新突破

[直播時(shí)間]

    2020年3月26日，16:00 - 17:00

[報(bào)告簡(jiǎn)介]

    提高轉(zhuǎn)染物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞核的效率目前仍然是基因編輯中的一大挑戰(zhàn)。FluidFM 技術(shù)能夠?qū)⑥D(zhuǎn)染物質(zhì)直接注射到細(xì)胞核中，從根本上解決這一難題。這一技術(shù)對(duì)于極難轉(zhuǎn)染或原代的細(xì)胞系的基因編輯有著十分重要的意義。

    本次研討會(huì)是關(guān)于“提高CRISPR基因編輯效率的全新方法”的網(wǎng)絡(luò)研討會(huì)。向您展示如何通過(guò)直接向細(xì)胞核中導(dǎo)入轉(zhuǎn)染物質(zhì)，從而解決細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低下的問(wèn)題。

特別提示：本次研討會(huì)還包括在線的實(shí)驗(yàn)演示！

[產(chǎn)品簡(jiǎn)介]

    瑞士Cytosurge公司多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)—FluidFM BOT，是將原子力系統(tǒng)、微流控系統(tǒng)、細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)為一體的單細(xì)胞操作系統(tǒng)。主要功能包括單細(xì)胞注射、單細(xì)胞提取以及單細(xì)胞分離。

    FluidFM BOT打開(kāi)了傳統(tǒng)單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)手段無(wú)法觸及領(lǐng)域的大門(mén)。突破了單細(xì)胞研究、藥物開(kāi)發(fā)、細(xì)胞系開(kāi)發(fā)中的障礙，讓細(xì)胞膜不再成為阻礙單細(xì)胞研究的壁壘。

    多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT濃縮了FluidFM科技的全部精華，尤其是在自動(dòng)化程度和操作速度上的提高。它不僅保留了產(chǎn)品在生物學(xué)上的能力。更能夠?qū)⑦@些功能進(jìn)行組合來(lái)創(chuàng)造更加GX、便捷全新試驗(yàn)方法。

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