一篇在線發(fā)表于《細(xì)胞》雜志的論文介紹了一項重要突破：來自韓國的研究團隊***在線粒體DNA中實現(xiàn)A堿基到G堿基的轉(zhuǎn)換，為基因編輯技術(shù)填補上一塊***關(guān)重要的拼圖，也帶來了治愈多種線粒體遺傳病的希望。

從上世紀(jì)60年代***發(fā)現(xiàn)***性內(nèi)切酶，到1985年發(fā)明PCR技術(shù)，再到***近十年CRISPR技術(shù)誕生、用于活體生物的基因編輯，短短半個世紀(jì)，人類在一次又一次的突破中實現(xiàn)了操縱DNA能力的巨大飛躍。其中，CRISPR的出現(xiàn)更是讓科學(xué)家能高效編輯基因組中的致病突變，為眾多遺傳病提供全新的方案。

不過，還有一朵烏云長期籠罩在基因編輯領(lǐng)域的上空，這就是線粒體DNA的編輯。

作為參與能量代謝的重要細(xì)胞器，線粒體中也含有少量來自母系的DNA。如果這部分基因發(fā)生突變，則可能導(dǎo)致多種與代謝相關(guān)的遺傳疾病。

例如，Leber遺傳性視神經(jīng)病變（LHON）可能導(dǎo)致患者失明，這種兇險的疾病就是由線粒體DNA的點突變導(dǎo)致的。線粒體DNA突變還可能導(dǎo)致某些線粒體腦肌病，患者的大腦遭受損傷，可能出現(xiàn)癲癇、精神行為異常等癥狀。平均每5000個人里，就有一個人患上線粒體點突變導(dǎo)致的遺傳病。

盡管基因編輯工具***近十年迎來爆發(fā)式發(fā)展，但面對線粒體遺傳病時，這些工具卻總是難以奏效。例如，當(dāng)下***為盛行的CRISPR-Cas系統(tǒng)就因為向?qū)NA不能穿越線粒體膜，因而無法用于線粒體疾病。

線粒體DNA的編輯，可以說是基因編輯領(lǐng)域***后一塊未經(jīng)涉足的土地，而這個難題也成為治愈多種遺傳疾病必須跨越的障礙。

2020年，一項***性的突破到來。Broad研究所的劉如謙教授團隊開發(fā)了一款名為DdCBE的基因編輯工具，可以直接修改雙鏈DNA上的堿基，實現(xiàn)從C堿基到T堿基的轉(zhuǎn)換，這也是科學(xué)家***在人體細(xì)胞中進行線粒體DNA的編輯。

不過，作為線粒體DNA編輯的開拓性成果，DaCBE也有不足之處：其只能高效地進行TC-TT序列的轉(zhuǎn)換，在90個已知的致病線粒體突變位點中，只有9個能得到修復(fù)。

而在這90個突變位點中，有多達39個都可以通過A-G堿基的轉(zhuǎn)換來修復(fù)。如果能找到實現(xiàn)A-G轉(zhuǎn)換的手段，那么包括上述兩種疾病在內(nèi)，多種線粒體遺傳病都有望迎來治愈的方法。

在這項發(fā)表于《細(xì)胞》的***新研究中，來自韓國基礎(chǔ)科學(xué)研究所基因編輯中心的研究團隊終于完成了這項“不可能的任務(wù)”，他們開發(fā)出一款全新的基因編輯平臺，命名為轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物相關(guān)脫氫酶（transcription activator-like effector-linked deaminases，簡稱TALED）。

▲TALED編輯線粒體DNA的示意圖

論文***作者CHO Sung-Ik表示：“我們設(shè)計的新型堿基編輯器極大地拓展了線粒體DNA編輯的范圍，這不僅有助于構(gòu)建疾病模型，還將幫助人們開發(fā)新療法?！?/p>

TALED到底是什么？接下來我們將看到，TALED由3個功能各異的主要部分組成，它們環(huán)環(huán)相扣、共同協(xié)作，***終完成這項基因編輯任務(wù)。

***個部分，可以看作TALED的向?qū)?。前面說到，常見的基因編輯系統(tǒng)無法進入線粒體。為了解決這個問題，TALED與劉如謙團隊開發(fā)的DaCBE一樣，使用了轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物（TALE）。作為一種DNA結(jié)合蛋白，TALE蛋白能夠靶向特異的DNA序列，其在線粒體靶向序列（MTS）的引導(dǎo)下進入線粒體，并且與特定的線粒體DNA序列結(jié)合。

到這里，TALED就被帶到了工作場所。在這里，輪到TALED的第二個部分登場。研究團隊需要找到合適的脫氫酶，在這里實現(xiàn)A-G堿基的轉(zhuǎn)換。為此，他們選擇是名為TadA8e的腺嘌呤脫氫酶，其由大腸桿菌的腺嘌呤脫氫酶改造而來。

這個選擇頗具創(chuàng)意，因為TadA8e被認(rèn)為是一種專門對單鏈DNA起作用的蛋白，但在這里，它需要在線粒體的雙鏈DNA中進行堿基編輯。

這篇論文的通訊作者，基因編輯中心主任KIM Jin-Soo教授說：“沒有人想過用TadA8e在線粒體中進行堿基編輯，因為它被認(rèn)為只對單鏈DNA起作用。正是這個跳出傳統(tǒng)框架的想法，幫助我們發(fā)明了TALED?！?/p>

而幫助TadA8e做到這一點的，是TALED的***后一個主要部分：胞嘧啶脫氫酶DddAtox。DddAtox使得雙鏈DNA可以短暫地解開，而TadA8e正是抓住了這個轉(zhuǎn)瞬即逝的時間窗口，在人類細(xì)胞的線粒體中高效催化A-G堿基的轉(zhuǎn)換，編輯頻率可高達49%。

▲TALED實現(xiàn)了A-G堿基的轉(zhuǎn)換

通過對TALED的調(diào)整，研究團隊分別開發(fā)出能同時實現(xiàn)A-G以及C-T堿基轉(zhuǎn)換的技術(shù)，以及僅進行A-G轉(zhuǎn)換的技術(shù)。

當(dāng)然，作為一項開創(chuàng)性的技術(shù)，TALED仍有不***之處，例如在進行堿基編輯時，可能會造成與目標(biāo)位點相鄰的核苷酸也發(fā)生轉(zhuǎn)換；此外，TALED是否會在哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生脫靶效應(yīng)也有待觀察。

但毫無疑問，TALED技術(shù)的出現(xiàn)讓我們又多了一種***潛力的基因編輯工具，展望這項技術(shù)的未來應(yīng)用場景，研究團隊希望能提升TALED的編輯效率與特異性，***終能夠分別在胚胎、新生兒與成年患者體內(nèi)修正致病的線粒體突變。我們期待，那些受困于線粒體遺傳病的人們終將迎來治愈的一刻。

RNA提取磁珠屬于納米生物磁珠的一種，主要作用是用于核酸提取過程中的RNA提取，粒徑分布在500nm左右，是洛陽吉恩特生物自主研發(fā)生產(chǎn)的高分子納米磁性微球，該磁珠懸浮時間長，磁響應(yīng)時間迅速，對DNA甲基化過程中的提取環(huán)節(jié)提供良好的支持，可明顯縮短實驗時間，提高實驗效率，并在提取結(jié)果上保持穩(wěn)定，配合核酸提取儀，更能實現(xiàn)快速的RNA提取。

哈佛大學(xué)的科學(xué)家已經(jīng)造出了這種神奇的食品包裝涂層。在一項發(fā)表于《自然?食品》的研究中，作者展示了如何利用天然材料實現(xiàn)食品包裝的***。

目前的塑料食品包裝需要消耗大量石油，并且難以降解。因此，研究團隊希望開發(fā)出一款更具可持續(xù)性、可降解并且無毒性的替代材料。這項研究的Philip Demokritou教授說：“同時我們也在問自己，我們能不能設(shè)計出能延長生鮮食品銷售時間、減少食物浪費并且提升食品安全的新型包裝?！?/p>

這款新型材料的主體成分，是由普魯蘭多糖——一種由微生物天然發(fā)酵形成的多糖——構(gòu)成的纖維結(jié)構(gòu)。這種多糖被FDA認(rèn)定為“通常被認(rèn)為是安全的”（GRAS）成分。此外，纖維結(jié)構(gòu)中還添加了天然抗jun成分，包括百里香精油、檸檬酸和乳酸鏈球菌肽。

相比于現(xiàn)有的食品膜，纖維結(jié)構(gòu)材料的表面積/體積比更高，因此攜帶的成分可以更高效地發(fā)揮作用，以更低的成本解決病原體污染食品的問題。

為了讓材料附著在食物表面，研究團隊開發(fā)出一套高通量的噴涂設(shè)備：以水為溶劑，直接噴涂***新鮮食物的表面，形成纖維保護層。

▲這套設(shè)備能將涂層均勻噴涂***食品表面

盡管看起來只是涂了一層膜，但這層材料足夠結(jié)實，可以避免運輸途中的磕傷；同時，材料包含的抗菌成分可以抵御大腸桿菌、李斯特菌等常見病原體。

以牛油果為例，研究團隊檢驗了這種材料的效果。牛油果在運輸途中仍會持續(xù)成熟，并且可能腐爛，因此有利于看清食品的保存情況。

經(jīng)過2~4分鐘的噴涂，牛油果被纖維涂層包裹。這時，牛油果的可銷售時間延長了50%。相比于對照組，它們的腐爛比例更低、菌群數(shù)量與質(zhì)量損失更少。而去除這層材料也很容易，只要水洗20秒就可以沖去，在土壤中僅需3天也可以降解。

▲對照實驗展示了涂層良好的保鮮效果

Demokritou教授道：“我們提出的是一項可規(guī)?；募夹g(shù)，它可以讓我們將生物聚合物轉(zhuǎn)變?yōu)槟軌蛑苯影澄锏睦w維。這將成為新一代更智能、綠色的食品包裝?！贝送猓芯繄F隊還通過實驗展示了大規(guī)模生產(chǎn)這款材料的潛力。

Demokritou教授說：“在過去五六十年間，我們已經(jīng)向環(huán)境排放了600萬噸塑料垃圾。它們的降解十分緩慢，而降解產(chǎn)生的微小顆粒也會隨著飲用水、食物甚***是空氣進入我們體內(nèi)?！倍芯繄F隊制造的智能纖維材料能消除菌株，確保食物的安全。這款全新設(shè)計的材料，或許將改變現(xiàn)有的食物存儲模式，引領(lǐng)下一場***。

11月19日北京時間23:00（巴黎時間：17:00），歐洲分子生物學(xué)實驗室研究員Moritz Kueblbeck將于Genomeweb平臺在線分享“在CRISPR編輯的細(xì)胞系中使用數(shù)字PCR進行標(biāo)記拷貝數(shù)評估”相關(guān)知識。

本網(wǎng)絡(luò)研討會將介紹如何使用dPCR快速定量CRISPR編輯的HeLa細(xì)胞中的綠色熒光蛋白拷貝數(shù)。討論還將介紹dPCR的工作原理和采集后的數(shù)據(jù)分析方法。

Moritz Kueblbeck在德國海德堡的癌癥研究ZX(DKFZ)做了八年的研究員。2014年,他加入了Jan Ellenberg在海德堡的歐洲分子生物學(xué)實驗室,在不同實驗室的項目中，他使用CRISPR/Cas9方法利用內(nèi)源性的標(biāo)記蛋白(在HeLa和U-2 OS細(xì)胞進行不同標(biāo)簽的純合敲入)進行人類細(xì)胞系基因組編輯。

內(nèi)容簡介

l  熒光蛋白或自標(biāo)記是使用熒光顯微鏡研究活細(xì)胞中蛋白質(zhì)動力學(xué)的寶貴工具。然而，定量成像需要目標(biāo)蛋白(POI)的生理表達水平，特別是當(dāng)需要研究POI的化學(xué)計量相互作用時。

l  CRISPR使研究人員能夠標(biāo)記幾乎任何感興趣的目標(biāo)基因，使其可以研究相應(yīng)POI的生理表達水平。然而，正確編輯細(xì)胞克隆的產(chǎn)生和選擇——即標(biāo)記等位基因的預(yù)期數(shù)量和缺乏額外的整合——需要對標(biāo)記的拷貝數(shù)進行定量評估。

l  探討dPCR是一種快速、可靠的熒光標(biāo)記CRISPR編輯細(xì)胞定量檢測方法。

注冊地址：https://event.on24.com/eventRegistration/EventLobbyServlet?target=reg20.jsp&partnerref=stilla&eventid=2111188&sessionid=1&key=2206BD6DA2548F0F9C46911E3A71DD

[主題]

    FluidFM：CRISPR基因編輯技術(shù)的新突破

[直播時間]

    2020年3月26日，16:00 - 17:00

[報告簡介]

    提高轉(zhuǎn)染物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞核的效率目前仍然是基因編輯中的一大挑戰(zhàn)。FluidFM 技術(shù)能夠?qū)⑥D(zhuǎn)染物質(zhì)直接注射到細(xì)胞核中，從根本上解決這一難題。這一技術(shù)對于極難轉(zhuǎn)染或原代的細(xì)胞系的基因編輯有著十分重要的意義。

    本次研討會是關(guān)于“提高CRISPR基因編輯效率的全新方法”的網(wǎng)絡(luò)研討會。向您展示如何通過直接向細(xì)胞核中導(dǎo)入轉(zhuǎn)染物質(zhì)，從而解決細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低下的問題。

特別提示：本次研討會還包括在線的實驗演示！

[產(chǎn)品簡介]

    瑞士Cytosurge公司多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)—FluidFM BOT，是將原子力系統(tǒng)、微流控系統(tǒng)、細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)為一體的單細(xì)胞操作系統(tǒng)。主要功能包括單細(xì)胞注射、單細(xì)胞提取以及單細(xì)胞分離。

    FluidFM BOT打開了傳統(tǒng)單細(xì)胞實驗手段無法觸及領(lǐng)域的大門。突破了單細(xì)胞研究、藥物開發(fā)、細(xì)胞系開發(fā)中的障礙，讓細(xì)胞膜不再成為阻礙單細(xì)胞研究的壁壘。

    多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT濃縮了FluidFM科技的全部精華，尤其是在自動化程度和操作速度上的提高。它不僅保留了產(chǎn)品在生物學(xué)上的能力。更能夠?qū)⑦@些功能進行組合來創(chuàng)造更加GX、便捷全新試驗方法。

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[聯(lián)系方式]             

[主辦方]

       榮登封面的這項研究成果來自哈佛***神經(jīng)科學(xué)家Joshua Sanes教授領(lǐng)銜的科學(xué)家團隊。研究人員采用高通量單細(xì)胞基因測序的方法，創(chuàng)建了靈長類動物的視網(wǎng)膜細(xì)胞型態(tài)分類圖譜，揭示為我們帶來敏銳視覺的細(xì)胞有哪些特殊的基因特征。這項研究同時為理解人類視覺在疾病情況下如何被破壞提供了重要的基礎(chǔ)。

      凹：讓我們看得清清楚楚明明白白真真切切

人類的視覺在哺乳動物中出類拔萃，比如我們能夠閱讀，分辨人臉。這些功能可不簡單，需要視覺能夠分辨極細(xì)微的差異，并能迅速對焦。高清視覺全得歸功于視網(wǎng)膜中間一個極小的特殊區(qū)域——***凹，也就是眼底黃斑的中心。凹的直徑不到1.5毫米，面積只占視網(wǎng)膜的不到1%，但大腦獲得的視覺信息卻有50%來自這里。

     凹的特殊，還不僅是因為視線的“焦點”落在此處提供清晰影像，要知道哺乳動物中只有部分靈長類生物進化出了這個結(jié)構(gòu)，比如人類。

▲“那（fovea）是個稀罕物，豈是什么生物都能有的？”

      凹為人類提供了視力的同時，卻讓科學(xué)家在解決人類視覺疾病時面臨一個難題。就拿實驗“勞?！毙∈髞碚f，雖然它們?yōu)槿祟惖目茖W(xué)研究提供了無數(shù)疾病模型，但它們“鼠目寸光”，視網(wǎng)膜沒有***凹！這種 “先天缺陷”讓它們在視覺相關(guān)疾病的模型上幫不上什么忙。再加上***凹結(jié)構(gòu)太微小了，過去科學(xué)家在靈長類動物上的研究也止于形態(tài)解剖學(xué)的描述。

     終，他們在凹和外周視網(wǎng)膜中均鑒定出了近70種不同類型的細(xì)胞，并且還知道了每一個類型的細(xì)胞表達哪些基因。

      詳盡的細(xì)胞分類圖譜給科學(xué)家們提供了許多過去不知道的信息。用Sanes教授的話說，“我們現(xiàn)在弄清楚了凹特別在哪里?！?/p>

▲凹的細(xì)胞和外周視網(wǎng)膜類型相似，但組成卻不同 

       盡管細(xì)胞類型九成相同，但***凹和外周視網(wǎng)膜的細(xì)胞類型組成不同。更關(guān)鍵的是，在同類型的細(xì)胞中，***凹處的細(xì)胞檢測到表達與外周不一樣的基因。非常有意思的是，這些基因的表達和***凹獨特的視覺信息處理極為相關(guān)，科學(xué)家們相信，可能這才是***凹功能特殊的原因。

       核酸提取產(chǎn)品對細(xì)胞篩選的方法已日漸成熟，原理是將包被一抗的磁珠與細(xì)胞表面對應(yīng)的分子特異性結(jié)合，或者將包被二抗的磁珠與已經(jīng)與細(xì)胞表面分子特異性結(jié)合的一抗結(jié)合。核酸提取磁珠攜帶與之結(jié)合的細(xì)胞吸附與分離柱或試管上，實現(xiàn)陽性細(xì)胞或陰性細(xì)胞的分離。洛陽吉恩特生物自主研發(fā)生產(chǎn)了各類核酸提取磁珠，可以實現(xiàn)穩(wěn)定的實驗結(jié)果。

ETAS軟件產(chǎn)品：RTA_用于ECU代碼開發(fā)

RTA產(chǎn)品系列包括RTA-OSEK， RTA-OS，RTA-RTE， RTA-TRACE以及相關(guān)的附加軟件。它們組成了一個完整的開發(fā)工具包，用于ECU代碼開發(fā)。

RTA-OSEK

RTA-OSEK可提供符合AUTOSAR-OS V1.0（SC-1）和OSEK-OS V2.2.3要求的解決方案，由以下工具及模塊組成：

Planner

建造應(yīng)用程序的時間模型并采用先進的時限單調(diào)性分析（Deadline Monotonic Analysis）法證明在運行時能夠滿足其所有的性能約束，并將解決問題所需的成本控制在Z小范圍之內(nèi)。  

Builder

自動為應(yīng)用程序中的各個任務(wù)和ISR（中斷服務(wù)程序）生成經(jīng)過優(yōu)化的頭文件以及OS數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)。利用靜態(tài)配置，可生成內(nèi)存使用量Z小的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，并可使用快速API調(diào)用來減小CPU的占用。

產(chǎn)品軟件模塊

在采用AUTOSAR-OS和OSEK-OS標(biāo)準(zhǔn)方面處于行業(yè)lingxian地位。它支持很多微控制器及編譯器，各個端口都單獨通過了認(rèn)證，確保了它們的兼容性。它還符合MISRA C標(biāo)準(zhǔn)的要求，確保可安全地進行嵌入式操作。 

RTA-OSEK可生成所有所需的測量模塊接口配置，使用戶可通過RTA-TRACE觀察應(yīng)用程序的運行情況。 

RTA-OS3.0

RTA-OS3.0是一種實時操作系統(tǒng)，其適用于汽車ECU設(shè)計所有領(lǐng)域的應(yīng)用。它同時滿足AUTOSAR R3.0 OS以及OSEK/VDX OS V2.2.3標(biāo)準(zhǔn)，且與MISRA C完全兼容。

RTA-RTE

RTA-RTE3.0是一種成熟且已量產(chǎn)的高質(zhì)量AUTOSAR運行環(huán)境（RTE）生成器，它符合AUTOSAR Release 3.0。

RTA-TRACE

RTA-TRACE通過以下功能提高調(diào)試速度：  

時間跟蹤

實時觀察應(yīng)用程序的運行情況，與軟件邏輯分析器的功能完全相同。

統(tǒng)計插入

自動計算系統(tǒng)中每個任務(wù)執(zhí)行時間的各種統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

ECU連接

設(shè)備驅(qū)動器和DLL可將ECU中的數(shù)據(jù)傳輸?shù)絉TA-TRACE PC、CAN、調(diào)試器及串行聯(lián)接中。ECU連接端口包使用戶可根據(jù)需要創(chuàng)建定制式的連接。

RTA-TCEL

RTA-TCEL提供了一種使用ES580通過CAN總線從目標(biāo)ECU向電腦主機傳輸數(shù)據(jù)的方法。

RTA-OSEK

RTA-OSEK具有一個適用于汽車ECU設(shè)計所有領(lǐng)域的生產(chǎn)型實時操作系統(tǒng)。它同時采用了 AUTOSAR-OS SC1和OSEK/VDX OS V2.2.3標(biāo)準(zhǔn)，并完全符合MISRA C的要求。它具有一個尺寸極小而且運行速度極快的內(nèi)核，該內(nèi)核適用于20多種微控制器。RTA-OSEK還結(jié)合了可用于對操作系統(tǒng)進行配置和分析的Planner和Builder工具。

Planner工具可針對應(yīng)用程序的實時時限建立模型并可提前預(yù)測該應(yīng)用程序的實時運行情況。Builder工具可用來生成該應(yīng)用程序的優(yōu)化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)和代碼。RTA-OSEK部件庫具有用于RTA-TRACE的可配置測量儀器。這樣，用戶便可使用功能強大且GX的開發(fā)程序來進行實時應(yīng)用程序的開發(fā)。

RTA-OSEK 具有系統(tǒng)資源占用低和先進的時間安排控制功能等特性，是動力總成系統(tǒng)及底盤電子應(yīng)用中的理想產(chǎn)品。車身電子模塊的設(shè)計者們非常看重這種極低的內(nèi)存使用量及堆棧優(yōu)化功能。同時，RTA-OSEK可進行廣泛的一致性檢查，并可自動生成設(shè)計檢查表和模板文件，因而十分有助于ECU軟件開發(fā)者們的開發(fā)工作。
RTA-OSEK在PC端口上也適用。這為AUTOSAR的虛擬開發(fā)和基于ECU應(yīng)用軟件的OSEC提供支持。例如，您可在您的電腦而不是產(chǎn)品硬件上進行開發(fā)。

功能一覽:

◆采用AUTOSAR-OS SC1標(biāo)準(zhǔn)  

◆通過OSEK/VDX OS標(biāo)準(zhǔn)所有等級要求的認(rèn)證

◆符合MISRA C要求  

◆支持8、16及32位微控制器

◆支持在標(biāo)準(zhǔn)Windows電腦上虛擬ECU的開發(fā)

◆低CPU占用

◆內(nèi)存要求小

◆系統(tǒng)時間可調(diào)度性（schedulability）、靈敏度、堆棧容量及Z小CPU速度分析

◆可自動生成優(yōu)化的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)  

◆方便使用的圖形界面 

◆獨特的單堆棧實現(xiàn)（ZL申請中），通?？晒?jié)省50-80%的應(yīng)用程序存儲空間

RTA-OS

RTA-OS3.0是一種實時操作系統(tǒng)，其適用于汽車ECU設(shè)計所有領(lǐng)域的應(yīng)用。它同時滿足AUTOSAR R3.0 OS以及OSEK/VDX OS V2.2.3標(biāo)準(zhǔn)，且與MISRA C完全兼容。

       RTA-OS3.0采用了行業(yè)內(nèi)lingxian的RTA-OSEK嵌入式技術(shù)。秉承minimum的運行時間耗費以及靈活配置的原則，RTA-OS3.0能為您的應(yīng)用軟件生成Z優(yōu)化的OS內(nèi)核。由于AUTOSAR OS具備充分的接口，包括時序和存儲器保護，所以O(shè)S配置和生成工具就必須將OS對整個系統(tǒng)所產(chǎn)生的影響Z小化。通過其創(chuàng)新的OS生成方式，RTA-OS3.0可以非常簡單地接至通用的汽車微控制器和編譯器上。ETAS對汽車應(yīng)用軟件的嵌入式軟件的需求有著深入的了解，而RTA-OS3.0就是專為新一代的AUTOSAR系統(tǒng)而開發(fā)的。

RTA-OS3.0可以與其他ETAS的軟件工程工具進行無縫整合；它與RTA-RTE（ETAS提供的AUTOSAR運行時環(huán)境生成器）完全兼容。此外，RTA-OS3.0還完全支持RTA-TRACE；這就讓您可以使用RTA-TRACE強大的可視化能力來對您應(yīng)用軟件的性能進行分析和測量。

為了支持AUTOSAR應(yīng)用軟件的虛擬開發(fā)，RTA-OS3.0將在一臺裝有Windows的個人電腦上進行編譯和執(zhí)行的能力作為標(biāo)準(zhǔn)。這一強大的特性使您可以看到您應(yīng)用軟件中新想法的結(jié)果，而不受ECU目標(biāo)硬件的影響。RTA-OS3.0可以安裝在您桌面上開始創(chuàng)建AUTOSAR應(yīng)用程序所需的所有開發(fā)工具。

功能概覽：

◆AUTOSAR R3.0 OS標(biāo)準(zhǔn)的工具

◆OSEK/VDX OS標(biāo)準(zhǔn)的所有匹配等級的認(rèn)證工具

◆與MISRA C相匹配的工具

◆支持8位、16位以及32位的微控制器

◆支持基于標(biāo)準(zhǔn)Windows電腦的虛擬ECU開發(fā)

◆很少的CPU開銷

◆需要很少的內(nèi)存

◆分析系統(tǒng)的可調(diào)度性、敏感性、堆棧大小以及minimumCPU運算速度

◆自動生成Z優(yōu)數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)

◆圖形接口易于使用

◆獨特的單堆棧實現(xiàn)工具，其通過適合的OS配置，一般可節(jié)省50%到80%的應(yīng)用軟件占用空間

RTA-OSEK

AUTOSAR運行環(huán)境（RTE）實現(xiàn)了應(yīng)用軟件組件的通訊基礎(chǔ)構(gòu)架、應(yīng)用軟件組件的實時調(diào)度以及應(yīng)用軟件組件與基本軟件模塊之間的接口。RTA-RTE3.0是一種成熟且已量產(chǎn)的高質(zhì)量AUTOSAR運行環(huán)境（RTE）生成器，它符合AUTOSAR Release 3.0。它是一種基于個人電腦的命令行工具，可以簡單的集成到各種建立環(huán)境中，以生成與AUTOSAR兼容的RTE。RTA-RTE產(chǎn)品線還包括了符合AUTOSAR Release 2.0的RTA-RTE2.0。RTA-RTE3.0幫助客戶解決許多涉及RTE生成過程的問題，例如，提供輸入XML配置信息的驗證、生成操作系統(tǒng)（OS）配置信息以及提供簡單的查錯能力。RTA-RTE3.0的另一個重要特征是，系統(tǒng)能夠在可能的時候?qū)ι蒖TE的資源使用量進行優(yōu)化，便于用戶作決定：應(yīng)該優(yōu)化代碼大?。▋?nèi)存）還是該優(yōu)化運行時間（CPU占用量）。RTA-RTE3.0生成的RTE獨立于編譯器和目標(biāo)，使其可以在廣泛的ECU平臺上使用。

功能概覽:

◆成熟的RTE生成工具

◆符合AUTOSAR Release 3.0

◆ 所生成的RTE對MISRA C完全兼容

◆與 RTA-OSEK 以及RTA-OS3.0的無縫整合

◆可以針對內(nèi)存或CPU占用率，對RTE資源的使用量進行優(yōu)化

◆可以非常簡便得與各種建立環(huán)境集成

◆驗證輸入數(shù)據(jù)（XML）的正確性和一致性

◆既支持AUTOSAR合同階段，也支持RTE生成階段

◆輸出OS配置，使RTE和OS的整合變得簡單

◆獨立于編譯器和目標(biāo)的RTE可以在廣泛的ECU平臺上使用

◆支持用C或C++編寫的SWCs，這些語言可作為源代碼或者是主體代碼

◆通過使用虛擬功能總線（VFB）來進行跟蹤，使查錯變得很簡單

◆ 生成的RTE與OSEK 2.2.3、AUTOSAR兼容

◆SC1及ERCOSEK V4.3操作系統(tǒng)

RTA-TRACE

LiveDevices軟件邏輯分析儀使用戶能夠：

◆通過復(fù)雜應(yīng)用程序運行情況的圖形顯示，加快調(diào)試過程。

◆借助于內(nèi)部操作系統(tǒng)（OS）事件的可視化來加強對應(yīng)用程序的控制并提高可信度。

◆借助于報告模塊，可輕松形成系統(tǒng)特性文檔。

◆通過詳細(xì)的統(tǒng)計分析，改善系統(tǒng)及模塊的驗證。

◆OS儀器包可靈活用于任何基于OSEK-OS、非OSEK-OS或調(diào)度程序的應(yīng)用程序。

◆支持多種標(biāo)準(zhǔn)ECU連接及靈活的ECU目標(biāo)連接組件，可方便地集成到任何開發(fā)環(huán)境中。 

RTA-TRACE是LiveDevices的一種新型跟蹤工具，使實時嵌入式軟件的開發(fā)更加簡單明了。通過RTA-TRACE，用戶可查看某個系統(tǒng)中復(fù)雜的實時交互作用， 從而更快地發(fā)現(xiàn)問題并加快軟件開發(fā)速度。RTA-TRACE可向開發(fā)者提供一個觀察應(yīng)用程序運行情況的窗口。開發(fā)者可從正在運行的應(yīng)用程序中捕獲跟蹤數(shù)據(jù)，以清晰的格式將其顯示出來，再快速對其進行解釋，從而可快速識別出缺陷并加以消除。

借助于RTA-TRACE，開發(fā)者可在與應(yīng)用程序開發(fā)所采用的相同的抽象層上進行開發(fā)工作；RTA-TRACE 可顯示由開發(fā)者創(chuàng)建的應(yīng)用程序的特征數(shù)據(jù) ，與使用C語言調(diào)試器作為基于OS的應(yīng)用程序代碼調(diào)試工具相比，這種方法向前邁進了一大步。RTA-TRACE可幫助用戶快速而GX地解決以下問題： 

◆任務(wù)/中斷程序的Z短、Z長及平均執(zhí)行時間是多少？

◆任務(wù)/中斷信號激活速率的抖動（jitter）是什么?

◆在運行時會出現(xiàn)什么樣的搶占（preemption）模式？

◆源/旗語（resource/semaphore）的使用是否會引起性能故障？

◆總CPU利用率是多少？

RTA-TRACE工具可在PC上運行并顯示從目標(biāo)ECU上捕獲的跟蹤數(shù)據(jù)。應(yīng)用程序中的相關(guān)測量接口配置（可記錄OS及用戶級事件數(shù)據(jù)）可將跟蹤數(shù)據(jù)存儲在目標(biāo)ECU的跟蹤緩沖器中。使用OS工具包（RTA-TRACE的組成部分），用戶可配置市場上的各種OSEK-OS (LiveDevices的另一種服務(wù))。此外，該工具包還可用于向任何自主開發(fā)的操作系統(tǒng)或循環(huán)應(yīng)用增加測量設(shè)備，這樣便可通過RTA-TRACE工具捕獲并分析跟蹤數(shù)據(jù)。

跟蹤數(shù)據(jù)通過ECU連接傳輸給主機系統(tǒng)。RTA-TRACE可用串行和基于調(diào)試器的方法進行ECU連接（可提供可選附加產(chǎn)品即基于CAN總線的ECU連接，RTA-TCEL）。RTA-TRACE 中的ECU連接端口組件使用戶可為其它物理層傳輸路徑開發(fā)出更多的ECU連接。

RTA-TCEL

       RTA-TCEL（Trace CAN ECU Link）是RTA-TRACE調(diào)試和分析工具的一個附件產(chǎn)品。RTA-TCEL提供了一種使用ES580通過CAN總線從目標(biāo)ECU向電腦主機傳輸數(shù)據(jù)的方法。
       RTA-TCEL支持附帶TouCAN控制器的MPC56x。同時，它還提供一個全功能接口工具包，以滿足開發(fā)人員連接RTA-TCEL和其它微處理器及CAN控制器的需求。
       RTA-TCEL可被用于具有通過控制器系統(tǒng)中單獨的CAN通道來通信；也可以與標(biāo)定用的CAN總線進行共享來發(fā)送跟蹤數(shù)據(jù)（文檔中提供示意圖來解釋如何和現(xiàn)有的CAN網(wǎng)絡(luò)軟件一起使用RTA-TCEL）。
       功能概覽:
       ◆從ECU到主機的高帶寬跟蹤數(shù)據(jù)傳輸
       ◆獨立或并行的標(biāo)定CAN通訊流量
       ◆支持ES580 CAN總線以及LIN總線PCMCIA卡

CRISPR-Cas9技術(shù)徹底改變了基礎(chǔ)生物研究和應(yīng)用生物技術(shù)的許多領(lǐng)域。但在臨床基因治療實施中脫靶效應(yīng)的檢測仍然存在難題。德國漢堡大學(xué)-艾本多夫醫(yī)學(xué)中心（UKE）干細(xì)胞移植、細(xì)胞和基因治療研究所的學(xué)者們近日在知名雜志《Molecular Therapy》上發(fā)表“LATE–a novel sensitive cell-based assay for the study of CRISPR/Cas9-related long-term adverse treatment effects”的文章，建立了稱為LATE（長期不良治療效果鑒定檢測）的新型檢測方法，該方法使用Stilla naica?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)檢測低頻的脫靶事件，且有助于分析Cas9脫靶切割效應(yīng)的影響，并可在單細(xì)胞層面進行評估。

為了證明LATE方法有助于檢測Cas9脫靶切割后的功能影響，研究人員進行了小規(guī)模的原理驗證實驗：明星基因TP53基因敲除后會導(dǎo)致細(xì)胞表現(xiàn)出相對生長優(yōu)勢，這是主要的致瘤性標(biāo)志之一，因此可以作為驗證“LATE”檢測脫靶能力的指示。本文選取TP53進行CRISPR靶向?qū)嶒?，并轉(zhuǎn)染到有限稀釋后的原代人類新生兒包皮成纖維NUFF細(xì)胞中，通過“LATE”方法重復(fù)檢測到低頻(<0.5%)生長促進事件，這一結(jié)果證明了即使在低起始細(xì)胞數(shù)的情況下，LATE檢測也具有高靈敏度，并且可以對單個細(xì)胞進行評估。

圖 1. LATE檢測原理

LATE檢測的原理包括 (1)用編碼熒光蛋白、設(shè)計的核酸酶(Cas9)和gRNA的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)原代人類新生兒包皮成纖維細(xì)胞 (NUFF)，(2) 使用流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)導(dǎo)率并連續(xù)監(jiān)控長達10周，(3)讀取結(jié)果，隨著轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞數(shù)量的增加，作為基因組編輯效應(yīng)的細(xì)胞獲得生長優(yōu)勢

在這一過程中，“LATE”讀取到的陽性結(jié)果（獲得生長優(yōu)勢的細(xì)胞）會不會由TP53以外的基因被“脫靶敲除”引起，或者是序列存在其他的突變，例如插入誘變從而導(dǎo)致細(xì)胞獲得生長優(yōu)勢呢?為了研究“LATE”檢測的陽性結(jié)果與TP53插入缺失之間的聯(lián)系，研究人員設(shè)計了GEF-dPCR（gene-editing frequency digital PCR）實驗，即Drop-Off分析方法，該方法可以量化gRNA結(jié)合位點以及脫靶位點的插入缺失頻率。

圖2. NUFF細(xì)胞獲得的生長優(yōu)勢與TP53中的插入/缺失頻率相關(guān) (A)TP53外顯子4片段和GEF-dPCR中使用的FAM、HEX標(biāo)記探針的示意圖。(B) TP53插入/缺失頻率，數(shù)據(jù)由GFR-dPCR測量獲得。(C) 脫靶TP53插入/缺失頻率，由GEF-dPCR測量獲得。

對于TP53 gRNA結(jié)合位點的檢測，GEF-dPCR使用兩個雙標(biāo)記水解探針，一個HEX標(biāo)記探針與遠(yuǎn)離gRNA識別序列的區(qū)域結(jié)合，易發(fā)生插入缺失的位點設(shè)計FAM標(biāo)記的探針（圖2A）。

文中使用Stilla naica?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)進行GFR-dPCR方法檢測，實驗方法詳見原文第12頁。

隨后進行Stilla naica?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)檢測，結(jié)果顯示隨著時間的推移，TP53插入缺失的頻率隨之增加，轉(zhuǎn)導(dǎo)后第7天插入缺失率為1%–22%，在52天后達到44%–85%的峰值，該變化趨勢和細(xì)胞獲得生長優(yōu)勢的趨勢一致。（圖2B）

研究人員還對TP53脫靶位點的插入缺失頻率進行了檢測（圖2C）。上述dPCR檢測結(jié)果也與NGS測序方法和RGB熒光標(biāo)記方法一致，從而說明“LATE”能夠檢測TP53介導(dǎo)的gRNA的不良脫靶效應(yīng)，但這些gRNA并沒有被常用的在線預(yù)測工具標(biāo)記為“危險信號”。

隨后，作者還驗證了“LATE”可用于任何類型的設(shè)計核酸酶以及不同的CRISPR/Cas變體，并且可以擴展用于其他細(xì)胞類型，尤其是高度相關(guān)的原代hMSC。因此，“LATE”實驗方案可用于驗證特定細(xì)胞類型中特定設(shè)計核酸酶的脫靶效應(yīng)的影響。

圖3：LATE檢測可應(yīng)用于hMSCs和h-TERT永生化細(xì)胞

綜上，“LATE”可以作為一種簡單、快速和經(jīng)濟的技術(shù)手段，用來評估CRISPR/Cas系統(tǒng)帶來的生理“副作用”影響，輔助臨床前的安全性研究，是對基于NGS的全基因組脫靶檢測方法的有效補充，特別是補充了流式和數(shù)字PCR的檢測結(jié)果。

期刊介紹：《Molecular Therapy》是美國基因治療學(xué)會(ASGT)的月刊，是基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、載體開發(fā)與設(shè)計、干細(xì)胞制造、基因、肽、蛋白、寡核苷酸的開發(fā)、細(xì)胞療法、疫苗開發(fā)、臨床前目標(biāo)驗證、安全性/有效性研究和臨床試驗等領(lǐng)域的領(lǐng)先期刊?！禡olecular Therapy》致力于促進遺傳學(xué)、醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)的科學(xué)發(fā)展，影響因子為6.698。

基因工程細(xì)胞的同質(zhì)性對于很多應(yīng)用都是必要條件，例如細(xì)胞株開發(fā)、基因ZL、組織工程以及細(xì)胞ZL與再生醫(yī)學(xué)。CRISPR/Cas9基因編輯存在脫靶等情況，無法直接得到均質(zhì)的細(xì)胞，因此需要開展單細(xì)胞克隆，之后才能用于臨床。

CloneSelect單細(xì)胞分離系統(tǒng)（CloneSelect Single Cell Printer）采用類似噴墨打印的技術(shù)，柔和地產(chǎn)生包裹細(xì)胞的液滴無接觸地直接分配到微孔板中（圖1）。同時，該系統(tǒng)借助智能圖像分析，確認(rèn)細(xì)胞數(shù)目，分析細(xì)胞的形態(tài)（大小和圓度）及熒光強度，聯(lián)動的真空裝置將不符合要求的液滴（如空液滴或者含多個細(xì)胞的液滴）直接吸走，而符合要求的細(xì)胞液滴則分配至微孔板，從而實現(xiàn)對單個細(xì)胞的分選和接種。單細(xì)胞分離系統(tǒng)是一種可比移液器操作的柔和的單細(xì)胞分離技術(shù)，而流式分選由于高的液體剪切力和電壓的影響，會降低敏感細(xì)胞和部分受損細(xì)胞（如電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞）的成克隆率，因此單細(xì)胞分離系統(tǒng)更適用于基因工程細(xì)胞的克隆，維持細(xì)胞活力，并提供直接的單克隆性圖像證據(jù)。

圖1：CloneSelect f.sight單細(xì)胞分離系統(tǒng)

最近發(fā)表的一篇文章（Characterization of CRISPR/Cas9 RANKL knockout mesenchymal stem cell clones based on single-cell printing technology and emulsion coupling assay as a low-cellularity workflow for single-cell cloning），作者用CRISPR/Cas9對間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）開展RANKL基因敲除以提高其骨骼形成能力。整個實驗流程起始于轉(zhuǎn)染，接著用CloneSelect f.sight單細(xì)胞分離系統(tǒng)開展單細(xì)胞克隆，隨后在DNA、RNA以及蛋白質(zhì)水平開展分析，ZH開展細(xì)胞功能分析（圖2）。

圖2：基因編輯間充質(zhì)干細(xì)胞的單細(xì)胞克隆及分析流程。（圖片來源：文獻1）。

作者在CRISPR/Cas9基因敲除質(zhì)粒中加入了GFP基因，轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞后，用具備熒光分選功能的CloneSelect f.sight系統(tǒng)分選出轉(zhuǎn)染成功的單細(xì)胞。系統(tǒng)可設(shè)定細(xì)胞直徑、圓度和熒光強度等指標(biāo)，分選出單個活細(xì)胞并接種至微孔板。圖3為系統(tǒng)分選基因編輯的間充質(zhì)干細(xì)胞的5張連續(xù)的圖像。通過瀏覽單細(xì)胞分離過程中記錄的5張連續(xù)的圖像，作者統(tǒng)計單細(xì)胞接種的成功率為93.9±2.7%（n=451），即僅有~6%的孔為多細(xì)胞孔，或空孔或無法確認(rèn)（圖4）。這一結(jié)果表明f.sight單細(xì)胞分離系統(tǒng)可以準(zhǔn)確地識別細(xì)胞并成功將其接種至微孔內(nèi)。

圖3：CloneSelect f.sight系統(tǒng)分選間充質(zhì)干細(xì)胞時采集的5張連續(xù)圖像，可用于證明單克隆性。（圖片來源：文獻¹）。

除了帶GFP的基因敲除質(zhì)粒外，作者還將pmaxGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至間充質(zhì)干細(xì)胞作為對照用于評估單細(xì)胞分離效率和克隆率。此外，作者轉(zhuǎn)染了多個不同的基因敲除質(zhì)粒。雖然不同的質(zhì)粒因為大小不同而呈現(xiàn)各異的轉(zhuǎn)染效率，但是成克隆率都達到了30%。此外，作者還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的間充質(zhì)干細(xì)胞（31.3±8%）和未轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞（39.6±15.6%）在成克隆率上差異較小，這也表明f.sight的單細(xì)胞分選過程柔和，因此產(chǎn)生的系統(tǒng)偏差較?。▓D4）。

圖4：CloneSelect f.sight單細(xì)胞分離系統(tǒng)的高接種效率（左）和高成克隆率（右）。（圖片來源：文獻¹）。

接著作者采用surveyor assay、RT-PCR和emulsion coupling分別從DNA、RNA和蛋白質(zhì)水平對基因編輯后的間充質(zhì)單細(xì)胞開展分析。ZH作者選出一株雙等位基因敲除的間充質(zhì)干細(xì)胞（g23d）檢測其成骨分化的能力，并以未編輯的MSC為對照開展平行實驗。細(xì)胞轉(zhuǎn)移到成骨分化培養(yǎng)基后，分別在第7天、14天和21天用茜素紅染色。在第14天，細(xì)胞失去細(xì)長的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，開始呈現(xiàn)出成骨細(xì)胞樣的形態(tài)，然后在第21天開始出現(xiàn)鈣沉積，發(fā)展過程與親本的MSC對照類似（圖5）。這表明基因編輯后的MSC其成骨分化能力并沒有因為基因編輯和篩選過程而受到影響。

圖5：RANKL基因敲除的間充質(zhì)干細(xì)胞（g23d）和親本間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)和成骨分化。（圖片來源：文獻1）。

在這個研究中，作者搭建了一整套實驗流程，起始于CRISPR/Cas9基因編輯，單細(xì)胞克隆以及DNA、RNA和蛋白質(zhì)各個水平的分析和細(xì)胞功能測試。實驗流程中采用CloneSelect f.sight單細(xì)胞分離系統(tǒng)成功GX地分選出基因編輯后帶GFP的間充質(zhì)干細(xì)胞。單細(xì)胞接種效率高達93.9% (± 2.7%)，且成克隆率高達31.3% (±8%)。相比傳統(tǒng)的有限稀釋法和流式分選，CloneSelect單細(xì)胞分離系統(tǒng)具有GX率，高活率，操作簡單，單克隆性證據(jù)充分等優(yōu)勢，是基因工程細(xì)胞克隆的理想工具。

基因編輯技術(shù)指能夠讓人類對目標(biāo)基因進行“編輯”，實現(xiàn)對特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技術(shù)自問世以來，就有著其它基因編輯技術(shù)無可比擬的優(yōu)勢，技術(shù)不斷改進后，更被認(rèn)為能夠在活細(xì)胞中最有效、最便捷地“編輯”任何基因。

但是在CRISPR基因編輯之后，工作并沒有結(jié)束，你需要驗證感興趣的基因是否成功突變。想知道如何利用高靈敏度、高jingzhun度的數(shù)字PCR技術(shù)來檢測基因編輯嗎？快來參加本次深藍云直播課堂吧！

近年來，隨著法規(guī)的推動，制藥人士對于分析方法生命周期的關(guān)注度越來越高。USP通則<1220>分析方法生命周期已于2022年5月1日生效，ICH Q14<分析方法開發(fā)>也已結(jié)束第三階段公開征求意見階段。ICH Q14指出，在分析方法開發(fā)時，可以使用基礎(chǔ)（即傳統(tǒng)型）方式或加強型方式。本文案例即使用加強型方式 — Fusion QbD軟件輔助生物藥分析方法開發(fā)。

摘要 

生物藥分析部門花費了大量時間開發(fā)耐用性好的分析方法，以保證原料藥和成品是純的，穩(wěn)定的。為了快速將產(chǎn)品應(yīng)用到患者身上，研發(fā)組織不斷地加快方法開發(fā)流程。提高分析方法開發(fā)效率的一個方法就是使用自動篩選和自動方法優(yōu)化工具。

Fusion QbD軟件可支持色譜不同分離模式的自動篩選流程。Fusion允許客戶輸入與分離模式相關(guān)的幾個因素進行研究。然后基于統(tǒng)計學(xué)設(shè)計實驗以評估這些因素的影響。設(shè)計好的DoE實驗可導(dǎo)入Empower，并自動在Empower中創(chuàng)建儀器方法和樣品組，減少方法開發(fā)過程中大量的人工工作量。Empower運行樣品后，結(jié)果再一鍵導(dǎo)入Fusion中做建模分析，評估各色譜參數(shù)。

Fusion-Empower工作流程 

在Fusion QbD中生成用戶自定義考察因素的DoE實驗設(shè)計。Fusion將儀器方法寫入到Empower中，處理后的樣品結(jié)果再導(dǎo)入Fusion中分析，得到更優(yōu)的色譜條件。

圖1.  Fusion Empower工作流程

案例1- WCX模式方法開發(fā)

• Fusion QbD自動篩選和自動優(yōu)化；

• 通過Fusion產(chǎn)生69個儀器方法和樣品組，并導(dǎo)入到Empower3； 

• 5個小時人工，120小時儀器運行時間；

• DoE實驗考察因素：pH、梯度時間、流動相組成、有機添加物、鹽濃度和柱溫；

• QbD開發(fā)的分析方法結(jié)果顯示：主峰峰形改善，酸性系列峰和堿性系列峰的分離度都提高了；

• 圖2為QbD開發(fā)好的分析方法和之前傳統(tǒng)方式開發(fā)了5個月的方法色譜對比圖：

圖2. WCX 液相分離模式（A. 傳統(tǒng)方式開發(fā)的分析方法色譜圖 ；B. Fusion QbD開發(fā)的色譜圖，顯示酸性系列峰和堿性系列峰的分離度都得到提高）。

案例1 - 疊加圖

將Empower結(jié)果導(dǎo)入到Fusion中，產(chǎn)生WCX HPLC疊加圖。基于客戶定義的方法性能指標(biāo)，白色區(qū)域是可接受性能區(qū)域，有顏色的區(qū)域是不滿足性能要求的區(qū)域。

圖3. 疊加圖顯示白色區(qū)域為滿足性能要求的可接受性能區(qū)域（左圖：鹽濃度vs梯度時間。右圖：鹽濃度vs. pH）。

案例2 - HILIC方法開發(fā) — Fusion QbD篩選

• Fusion QbD產(chǎn)生的38個儀器方法導(dǎo)入到Empower；

• 2個小時人工，15個小時儀器運行時間；

• DoE實驗考察的因素：pH、柱溫、梯度時間；

• 得到的分析方法顯示蛋白1和蛋白2的分離度提高，兩個蛋白的拖尾因子降低。

圖4. HILIC液相分離模式（A. 傳統(tǒng)方法開發(fā)的分析方法色譜圖；B. Fusion QbD開發(fā)的分析方法色譜圖，顯示蛋白1和蛋白2的分離度提高，拖尾因子降低）。

 結(jié)論 

Fusion QbD成功用于生物藥的方法開發(fā)，首先生成HILIC和陽離子交換模式的DoE實驗設(shè)計。然后使用Fusion中的導(dǎo)出功能，在Empower中自動創(chuàng)建DoE設(shè)計好的儀器方法和樣品組。通過自動篩選功能，HILIC方法實現(xiàn)了提高兩個蛋白峰的分離度目標(biāo)，陽離子交換方法實現(xiàn)了分離峰的數(shù)量和分離度的提高目標(biāo)。在Empower3中處理好的結(jié)果導(dǎo)入到Fusion，經(jīng)過統(tǒng)計和建模分析，得到了各個參數(shù)的操作空間(MODR)。使用Fusion QbD做方法開發(fā)節(jié)約的人工，大約為2.5個人工(FTE)一個月的工作時間。