從1985年至今的30多年時(shí)間里，PCR分析經(jīng)歷了三代技術(shù)的發(fā)展。DY代傳統(tǒng)PCR技術(shù)，采用瓊脂糖凝膠電泳的方法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定性分析。第二代熒光定量PCR技術(shù)，通過(guò)在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR進(jìn)程，ZH用Cq值對(duì)基因進(jìn)行定量分析。第三代數(shù)字PCR技術(shù)，通過(guò)將PCR反應(yīng)液進(jìn)行有限稀釋，實(shí)現(xiàn)核酸分子的單分子擴(kuò)增，ZZ采取終點(diǎn)法檢測(cè)陽(yáng)性微滴的熒光信號(hào)，有熒光信號(hào)的微滴判讀為 1；沒(méi)有熒光信號(hào)的微滴判讀為 0，因此該技術(shù)被稱為數(shù)字PCR。

PCR技術(shù)在不斷地蛻變卻從未淡出我們的視野，如今已經(jīng)滲透到分子生物學(xué)領(lǐng)域的各種研究層面。尤其在今年大流行疾病中，展現(xiàn)了PCR技術(shù)的強(qiáng)大之處。那在科學(xué)研究中，我們?cè)撊绾芜x擇傳統(tǒng)PCR 、熒光定量 PCR與數(shù)字 PCR呢？

首先我們要清楚，三代PCR技術(shù)所有的基礎(chǔ)源于PCR反應(yīng)的基本原理和PCR反應(yīng)的3個(gè)重要階段，分別是指數(shù)期、線性期和平臺(tái)期。

指數(shù)期

指數(shù)期內(nèi)，每個(gè)循環(huán)PCR產(chǎn)物量大約增加1倍（假定 100%反應(yīng)效率），該階段的擴(kuò)增反應(yīng)具有高度特異性和精確度。

線性期（高變異性）

隨著PCR反應(yīng)體系成分的消耗，其中的一個(gè)或者多種成分限制反應(yīng)，導(dǎo)致反應(yīng)開(kāi)始減緩，并且每個(gè)循環(huán)的PCR 產(chǎn)物不再加倍。

平臺(tái)期

反應(yīng)停止，不再產(chǎn)生更多的產(chǎn)物。因?yàn)槊總€(gè)樣品具有不同的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，所以每個(gè)反應(yīng)將在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)入平臺(tái)期，平臺(tái)期內(nèi)可以看到這些差異。

傳統(tǒng) PCR

傳統(tǒng)PCR通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR終產(chǎn)物進(jìn)行分析（圖2），它的局限性就在于只能做定性分析。在圖3中，3個(gè)反應(yīng)孔含有相同量的 DNA模板，但到達(dá)平臺(tái)期后產(chǎn)生的熒光信號(hào)卻不同，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物的量存在不同（反應(yīng)動(dòng)力學(xué)變化所致）。這也表明了傳統(tǒng)PCR平臺(tái)期測(cè)量時(shí)結(jié)果存在變異，產(chǎn)出的DNA量不一定能反映最初情況，所以無(wú)法進(jìn)行定量。

熒光定量 PCR

同樣在圖3中，發(fā)現(xiàn)在指數(shù)期內(nèi)，3個(gè)反應(yīng)孔的擴(kuò)增曲線完全重合，說(shuō)明指數(shù)期內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)將更加精確，可實(shí)現(xiàn)更加準(zhǔn)確的定量。閾值線是擴(kuò)增產(chǎn)物熒光強(qiáng)度超過(guò)背景時(shí)的一個(gè)熒光強(qiáng)度值，樣品達(dá)到此熒光強(qiáng)度值所經(jīng)過(guò)的循環(huán)數(shù)稱為Cq值。通過(guò)比較未知濃度的樣品與一系列標(biāo)準(zhǔn)品的Cq值，可以精確測(cè)定未知反應(yīng)中的模板 DNA數(shù)量。

數(shù)字 PCR

數(shù)字 PCR 是通過(guò)將樣本DNA隨機(jī)分布至獨(dú)立的反應(yīng)單元中，每個(gè)反應(yīng)單元中包含或者不包含1個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子，所有獨(dú)立的反應(yīng)單元進(jìn)行平行擴(kuò)增后，對(duì)每個(gè)反應(yīng)單元的陰性或者陽(yáng)性熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，就可以計(jì)算出原始樣本的拷貝數(shù)，無(wú)需參考標(biāo)準(zhǔn)品或內(nèi)源性對(duì)照品，也不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線。

傳統(tǒng)PCR 、熒光定量 PCR與數(shù)字 PCR的選擇

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Naica?微滴芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國(guó)Stilla Technologies Naica數(shù)字PCR平臺(tái)是實(shí)現(xiàn)高靈敏DNA/RNAJD定量的技術(shù)工具，只需一步移液操作，即可自動(dòng)生成單層平鋪的微滴，同一反應(yīng)液進(jìn)行多基因的單分子模板擴(kuò)增，通過(guò)三色或六色熒光通道檢測(cè)，自動(dòng)QC質(zhì)控，識(shí)別多色熒光中有效的陰陽(yáng)性微滴，從而達(dá)到目的DNA/RNA的高JZjuedui定量。同時(shí)提供原始數(shù)據(jù)、單微滴追溯等功能，確保數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。

參考文獻(xiàn)：

1. Sykes PJ, Neoh SH, Brisco MJ, Hughes E, Condon J, Morley AA. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 1992;13(3):444-449.

2. Vogelstein B , Kinzler K W . Digital PCR[J]. Proceedings of the National Academy of ences of the United States of America, 1999, 96(16):9236-9241.

3. Heyries KA, Tropini C, Vaninsberghe M, et al. Megapixel digital PCR. Nat Methods. 2011;8(8):649-651.

4. Dingle TC, Sedlak RH, Cook L, Jerome KR. Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clin Chem. 2013;59(11):1670-1672.

5. Whale AS, Huggett JF, Cowen S, et al. Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation. Nucleic Acids Res. 2012;40(11):e82.

【數(shù)字PCR網(wǎng)絡(luò)研討會(huì)】

在CRISPR編輯的細(xì)胞系中

使用數(shù)字PCR進(jìn)行標(biāo)記拷貝數(shù)評(píng)估

       11月19日北京時(shí)間23:00（巴黎時(shí)間：17:00），歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室研究員Moritz Kueblbeck將于Genomeweb平臺(tái)在線分享“在CRISPR編輯的細(xì)胞系中使用數(shù)字PCR進(jìn)行標(biāo)記拷貝數(shù)評(píng)估”相關(guān)知識(shí)。

本網(wǎng)絡(luò)研討會(huì)將介紹如何使用dPCR快速定量CRISPR編輯的HeLa細(xì)胞中的綠色熒光蛋白拷貝數(shù)。討論還將介紹dPCR的工作原理和采集后的數(shù)據(jù)分析方法。

Moritz Kueblbeck在德國(guó)海德堡的癌癥研究ZX(DKFZ)做了八年的研究技術(shù)員。2014年,他加入了Jan Ellenberg在海德堡的歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,在不同實(shí)驗(yàn)室的項(xiàng)目中，他使用CRISPR/Cas9方法利用內(nèi)源性的標(biāo)記蛋白(在HeLa和U-2 OS細(xì)胞進(jìn)行不同標(biāo)簽的純合敲入)進(jìn)行人類(lèi)細(xì)胞系基因組編輯。

內(nèi)容簡(jiǎn)介

l  熒光蛋白或自標(biāo)記是使用熒光顯微鏡研究活細(xì)胞中蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)的寶貴工具。然而，定量成像需要目標(biāo)蛋白(POI)的生理表達(dá)水平，特別是當(dāng)需要研究POI的化學(xué)計(jì)量相互作用時(shí)。

l  CRISPR使研究人員能夠標(biāo)記幾乎任何感興趣的目標(biāo)基因，使其可以研究相應(yīng)POI的生理表達(dá)水平。然而，正確編輯細(xì)胞克隆的產(chǎn)生和選擇——即標(biāo)記等位基因的預(yù)期數(shù)量和缺乏額外的整合——需要對(duì)標(biāo)記的拷貝數(shù)進(jìn)行定量評(píng)估。

l  探討dPCR是一種快速、可靠的熒光標(biāo)記CRISPR編輯細(xì)胞定量檢測(cè)方法。

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法國(guó)Stilla Technologies公司開(kāi)發(fā)的—款多重PCR專用預(yù)混液：naica^?multiplex PCR MIX（見(jiàn)表1），專用于naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的多重檢測(cè)。并對(duì)naica^?multiplex PCR MIX的多重檢測(cè)性能進(jìn)行了詳細(xì)評(píng)估。當(dāng)面對(duì)有限的樣本量時(shí)，可保證多重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性；在復(fù)雜背景基因存在的情況下，依然能精確檢出低豐度的目的基因。

★ naica^?multiplex PCR MIX在naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR上進(jìn)行6個(gè)靶標(biāo)的同步準(zhǔn)確定量

采用0.2~13000cp/ul的DNA樣品，使用10X naica^?multiplex PCR MIX在naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)上進(jìn)行6個(gè)靶標(biāo)的線性范圍分析，結(jié)果顯示6個(gè)靶標(biāo)的R²均＞0.99，說(shuō)明在naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)上，能夠可靠地實(shí)現(xiàn)6靶標(biāo)同步準(zhǔn)確定量（圖1)。與2X和5X濃度的數(shù)字PCR預(yù)混液(dPCR Mixes)相比，10X濃度的數(shù)字PCR預(yù)混液體積加入量降低了50％至80％，最大限度地提高樣品加入量。尤其是在檢測(cè)低濃度樣品或稀有靶標(biāo)時(shí)，樣品加入量的增加可提高檢測(cè)靈敏度。

▲ 圖1：使用naica^?multiplex PCR MIX在naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR上進(jìn)行6個(gè)靶標(biāo)的線性分析，分別在藍(lán)色、青色、綠色、黃色、紅色和紅外線6個(gè)通道進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)稀釋點(diǎn)的DNA濃度分別為：0.2、1.5、8.0、50、320、2050和13000 cp/ul，每個(gè)稀釋度進(jìn)行3次重復(fù)。結(jié)果顯示6個(gè)靶標(biāo)的R2均大于0.99，說(shuō)明所有靶標(biāo)的結(jié)果都高度真實(shí)可靠。

★ 在復(fù)雜的背景基因下，對(duì)低豐度目的基因進(jìn)行精確定量

數(shù)字PCR的—個(gè)重要技術(shù)優(yōu)勢(shì)是能夠在存在多個(gè)靶標(biāo)擴(kuò)增的情況下檢測(cè)到低濃度靶標(biāo)。為了評(píng)估naica^?multiplex PCR MIX的穩(wěn)定性。使用同一個(gè)目標(biāo)DNA模板的不同濃度系列稀釋液（0.2~ 13000 cp/uL)進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)其中摻入5種外部靶標(biāo)模板（每個(gè)靶標(biāo)的濃度為3000 cp/ul)。在不同測(cè)試條件下，結(jié)果均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖2A和2C)。這些結(jié)果與同一DNA 靶點(diǎn)在不同濃度下單獨(dú)檢測(cè)以及在不添加外部靶標(biāo)的情況下獲得的結(jié)果具有可比性（圖2B和2D）。

▲ 圖2：使用naica^?multiplex PCR MIX的擴(kuò)增結(jié)果真實(shí)可靠。將pUC18質(zhì)粒（圖A和B)和pUC57質(zhì)粒（圖C和D)的13000至0.2 cp/ul的系列稀釋液在5個(gè)外部擴(kuò)增靶標(biāo)背景下（每個(gè)靶標(biāo)為3000 cp/ul(A,C)）和在不含外部靶標(biāo)(B,D)的情況下進(jìn)行定量檢測(cè)，3次重復(fù)。線性擬合系數(shù) R2>0.99，表明在不考慮多重背景的情況下，對(duì)所有靶標(biāo)的測(cè)定結(jié)果都是真實(shí)可靠的。5個(gè)外部靶標(biāo)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差保持在2.3％至3.1% (n=21)，顯示出極好的重復(fù)性。

★ naica^?multiplex PCR MIX應(yīng)用亮點(diǎn)

?  實(shí)現(xiàn)數(shù)字PCR方法多重檢測(cè)的高度穩(wěn)定性和高檢測(cè)靈敏度；

?  可在naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)同時(shí)定量檢測(cè)6個(gè)獨(dú)立的DNA靶標(biāo)，均具有良好線性關(guān)系；

?  5X和10X的數(shù)字PCR預(yù)混液，提高了naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)高階多重檢測(cè)能力；

?  10X PCR MIX比5X PCR MIX降低50％的體積用量，從而增加DNA的加入量。在檢測(cè)低濃度樣品或稀有靶標(biāo)時(shí)，樣本加入量的增加可提高檢測(cè)靈敏度。

表1 naica^?multiplex PCR MIX貨號(hào)及規(guī)格

naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國(guó)Stilla Technologies公司naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片式數(shù)字PCR技術(shù)，自動(dòng)化微滴生成和擴(kuò)增，每個(gè)樣本孔可實(shí)現(xiàn)6熒光通道的檢測(cè)，智能化識(shí)別微滴并進(jìn)行質(zhì)控，3小時(shí)內(nèi)即可獲得至少6個(gè)靶標(biāo)基因的拷貝數(shù)濃度。