如今，隨著快速無創(chuàng)篩查、癌癥檢測以及臨床測序應(yīng)用的擴大，診斷行業(yè)已經(jīng)鋪平了通往JZYL時代的道路。隨著市場對更kuai、更jingque診斷的需求，以及監(jiān)管的不斷發(fā)展，診斷專業(yè)人士需要一個能夠幫助他們建立伙伴關(guān)系、獲取行業(yè)知識、與同行建立網(wǎng)絡(luò)并從同行那里學(xué)習(xí)的綜合平臺，共同討論診斷行業(yè)的發(fā)展、里程碑、挑戰(zhàn)和機遇。第12屆Next-Generation Dx峰會將于8月25日-27日（美東時間）進(jìn)行線上舉辦。

會議期間Stilla Technologies公司也將聚焦“液體活檢”進(jìn)行交流互動，針對6色Crystal Digital PCR?系統(tǒng)的多重檢測能力進(jìn)行zuixin技術(shù)的分享，大家可以觀看Stilla Technologies應(yīng)用專家Kimberley Gutierrez博士的演講，并且在會議現(xiàn)場可以訪問我們的線上展位。

Kimerley Gutierrez博士將介紹Stilla的6色Crystal Digital PCR?系統(tǒng)，并闡述其是如何創(chuàng)建1個panel可同時對至少6個癌癥突變位點進(jìn)行檢測。該報告將于美國東部時間8月25日下午1點25分在“液體活檢”ZT節(jié)目中播出。

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時間

2020年8月25-27日（美東時間）

會議ZT日程

數(shù)字PCR為第三代PCR技術(shù)，憑借較高靈敏度和jingzhun度廣泛應(yīng)用于核酸檢測領(lǐng)域。目前，越來越多的領(lǐng)域都會用到數(shù)字PCR（dPCR）技術(shù)，但關(guān)于實驗細(xì)節(jié)和結(jié)果評估缺少一個共識。在很多發(fā)表的文章中都缺乏足夠的dPCR實驗細(xì)節(jié)，這樣不利于評審文章，甚至難以根據(jù)文章重復(fù)實驗。

本期在線研討會給大家介紹通過6色熒光數(shù)字PCR技術(shù)檢測乳腺癌相關(guān)靶點，并借此闡述了整個數(shù)字PCR操作流程以及如何運用MIQE，希望對大家的文章發(fā)表能有所幫助，少走彎路，多發(fā)好文章。

掃描二維碼進(jìn)入直播間

全封閉Naica數(shù)字PCR新型冠狀病毒超敏檢測方案

Cycloud與MicroFuture合作

深藍(lán)云生物科技與北京微未來科技，基于國家疾控ZX和WHO推薦區(qū)域，針對2019新型冠狀病毒的四段保守序列作為檢測靶標(biāo)，開發(fā)超敏的數(shù)字PCR檢測方法和快速的定量PCR檢測方法。

【圖源：北京微未來科技】

區(qū)段分別為：RdRP基因（特異性靶點），E蛋白基因，N蛋白基因，保守基因S區(qū)位點。確保對2019新型冠狀病毒鑒定的高度特異性和靈敏度。      

與人冠狀病毒HcoV-229E、 HcoV-HKU1、 HcoV-OC43、 HcoV-NL63等型無交叉。

深藍(lán)云生物科技以專業(yè)服務(wù)科學(xué)為使命，愿所學(xué)，以致用，共戰(zhàn)病毒！

北京微未來科技有限公司以“解碼病原微生物，致力于傳染病防控”為企業(yè)使命。與北京深藍(lán)云生物科技共同在病毒的超敏檢測的數(shù)字PCR方法展開深入合作。 

聯(lián)系方式：

公司名稱：北京深藍(lán)云生物科技有限公司
聯(lián)系電話：010-57256059
E-mail：info@cycloudbio.com

11月19日北京時間23:00（巴黎時間：17:00），歐洲分子生物學(xué)實驗室研究員Moritz Kueblbeck將于Genomeweb平臺在線分享“在CRISPR編輯的細(xì)胞系中使用數(shù)字PCR進(jìn)行標(biāo)記拷貝數(shù)評估”相關(guān)知識。

本網(wǎng)絡(luò)研討會將介紹如何使用dPCR快速定量CRISPR編輯的HeLa細(xì)胞中的綠色熒光蛋白拷貝數(shù)。討論還將介紹dPCR的工作原理和采集后的數(shù)據(jù)分析方法。

Moritz Kueblbeck在德國海德堡的癌癥研究ZX(DKFZ)做了八年的研究員。2014年,他加入了Jan Ellenberg在海德堡的歐洲分子生物學(xué)實驗室,在不同實驗室的項目中，他使用CRISPR/Cas9方法利用內(nèi)源性的標(biāo)記蛋白(在HeLa和U-2 OS細(xì)胞進(jìn)行不同標(biāo)簽的純合敲入)進(jìn)行人類細(xì)胞系基因組編輯。

內(nèi)容簡介

l  熒光蛋白或自標(biāo)記是使用熒光顯微鏡研究活細(xì)胞中蛋白質(zhì)動力學(xué)的寶貴工具。然而，定量成像需要目標(biāo)蛋白(POI)的生理表達(dá)水平，特別是當(dāng)需要研究POI的化學(xué)計量相互作用時。

l  CRISPR使研究人員能夠標(biāo)記幾乎任何感興趣的目標(biāo)基因，使其可以研究相應(yīng)POI的生理表達(dá)水平。然而，正確編輯細(xì)胞克隆的產(chǎn)生和選擇——即標(biāo)記等位基因的預(yù)期數(shù)量和缺乏額外的整合——需要對標(biāo)記的拷貝數(shù)進(jìn)行定量評估。

l  探討dPCR是一種快速、可靠的熒光標(biāo)記CRISPR編輯細(xì)胞定量檢測方法。

注冊地址：https://event.on24.com/eventRegistration/EventLobbyServlet?target=reg20.jsp&partnerref=stilla&eventid=2111188&sessionid=1&key=2206BD6DA2548F0F9C46911E3A71DD

AnielloFederico*,JochenUtikalSkinCancerUnit,GermanCancerResearchCenter(DKFZ),69120Heidelberg,Germany.*Correspondingauthor.E-mailaddress:a.federico@dkfz-heidelberg.de

為了研究腫瘤微環(huán)境影響下腫瘤細(xì)胞的運動性和侵襲特性，建立了體外2D侵襲方案。這種2D侵襲方案是一種共培養(yǎng)試驗，在這種情況下，是由腫瘤和基質(zhì)細(xì)胞（例如成纖維細(xì)胞）組成的。一旦兩種細(xì)胞類型接觸，在不同的條件下評估侵襲成纖維細(xì)胞單層的腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，在我們的研究中，我們在模擬實體腫瘤微環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的條件，例如與基質(zhì)細(xì)胞（成纖維細(xì)胞）的相互作用以及成纖維細(xì)胞釋放的可溶性因子（Nnetu等，2012）。我們使用A375黑色素瘤細(xì)胞系和真pi成纖維細(xì)胞進(jìn)行了此測定。黑色素瘤細(xì)胞激活成纖維細(xì)胞，繼而維持腫瘤細(xì)胞的生長，惡性轉(zhuǎn)化和耐藥性（Flach等，2011）。然而，在刺激所測試的抗ai化合物后，我們發(fā)現(xiàn)與成纖維細(xì)胞直接接觸的黑素瘤細(xì)胞顯示出運動能力受損并且未能侵襲成纖維細(xì)胞層。

材料和試劑

1. GFP-A375細(xì)胞系（ATCC）

2. 番茄皮成纖維細(xì)胞（從健康患者中分離）

3. MEF細(xì)胞培養(yǎng)基

4.PBS（Sigma-Aldrich；D8537）

5.胰蛋白酶-EDTA溶液（Sigma-Aldrich；T3924）

6. 臺盼藍(lán)溶液（Sigma-Aldrich;93595）

7.DMSO（CarlRoth;A994.2），在0.1％最終濃度下使用

8.MithramycinA（BioTrend；10-2085-5mg），在300nm濃度下使用，用DMSO稀釋

儀器設(shè)備

1. 層流凈化罩

2. 12/24孔多孔板（GreinerBio-One）

3. 臺式離心機

4. 細(xì)胞計數(shù)器

5. 2孔插件（ibidi: 80209）/預(yù)置2孔插件培養(yǎng)皿（ibidi:81176）

6.細(xì)胞培養(yǎng)管

7. 渦旋

8. 鑷子

9. 光學(xué)顯微鏡

10. 熒光顯微鏡

11. NIS-Elements軟件

ibidi:81176

實驗流程

01. 將GFP-A375和番茄成纖維細(xì)胞系穩(wěn)定地保存在MEF培養(yǎng)基中，在37°C和5%C02加濕培養(yǎng)箱中。

02. 當(dāng)細(xì)胞達(dá)到亞融合度（約80％融合度）時，在帶有PBS的通風(fēng)櫥中清洗它們，以去除死細(xì)胞和碎片。

03. 在培養(yǎng)箱中用胰蛋白酶-EDTA溶液胰蛋白酶消化細(xì)胞約5分鐘，然后添加MEF培養(yǎng)基以阻止反應(yīng)。

04. 將細(xì)胞懸浮液收集在15ml細(xì)胞培養(yǎng)管中，并用臺式離心機（1500xg,5′,RT）短暫離心。

05. 將細(xì)胞重新懸浮在新鮮培養(yǎng)基中；將一體積的細(xì)胞懸液與另一體積的臺盼藍(lán)溶液混合，用細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)活細(xì)胞。

06. 在MEF緩沖液中以4x105細(xì)胞/ml的濃度稀釋細(xì)胞。

07. 在多孔板上，在每個孔的中間放置一個Culture-Insert2孔（2孔培養(yǎng)插件）。

08. 用75μl（3x104細(xì)胞）FP-A375細(xì)胞填充插入物一側(cè)，并用番茄成纖維細(xì)胞填充另一側(cè)。用移液器上下混合插入物中的細(xì)胞，以確保細(xì)胞完全分布。

09. 將多孔板放在培養(yǎng)箱中，放置過夜。

10. 第二天，在鑷子的幫助下，小心地從每孔中取出培養(yǎng)基和插件，并用PBS清洗。

11. 小心除去PBS，然后加入新鮮的MEF培養(yǎng)基。

12. 用光學(xué)顯微鏡檢查GPF-A375與Tomto成纖維細(xì)胞之間產(chǎn)生的間隙的閉合狀態(tài)。

13. 一旦每個孔中的間隙完全閉合，請使用熒光顯微鏡和成像軟件獲取熒光圖像。確保腫瘤細(xì)胞尚未侵入成纖維細(xì)胞單層。

14. 小心地除去培養(yǎng)基，并在控制組孔中添加培養(yǎng)基+0.1％PBS，在處理組孔中添加培養(yǎng)基+300nM絲裂霉素A。將板放在培養(yǎng)箱中24小時（處理孵育時間）。

24小時后，在熒光顯微鏡下重新采集共培養(yǎng)孔，以評估治療組與對照組（綠色熒光細(xì)胞散布在紅色標(biāo)記層上）的腫瘤細(xì)胞侵襲行為的任何變化（圖2）。

圖1：2D侵襲系統(tǒng)的示意圖

圖2：2D侵襲檢測的熒光圖像

將黑素瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，然后暴露于300nmMithramycinA（或DMSO）。24小時后，評估侵襲成纖維細(xì)胞層的腫瘤細(xì)胞的數(shù)目。A375細(xì)胞顯示出大規(guī)模的侵襲行為，受到MithramycinA治療的損害。比例尺：500μm。

備注：

1.此處描述了MEF培養(yǎng)基組成（參考文獻(xiàn)1）。

2.此文僅供參考。

3.此實驗方案來自ibidi的實際用戶，更多詳情可聯(lián)系本文作者。

參考文獻(xiàn)：

1.MithramycinAandmithralogEC-8042inhibitSETDB1expressionanditsoncogenicactivityinmalignantmelanoma. FedericoA,SteinfassT,LarribèreL,NovakD,MorísF,Nú?ezLE,UmanskyV,UtikalJ.MolelucarTherapy-Oncolytics2020;doi: https://doi.org/10.1016/j.omto.2020.06.001 (Methoddescribedinthisprotocolwasincludedinthispublishedarticle).

2.Theimpactofjammingonboundariesofcollectivelymovingweak-interactingcells. NnetuKD,KnorrM,K?sJ,ZinkM.NewJournalofPhysics2012;doi:https://doi.org/10.1088%2F1367-2630%2F14%2F11%2F115012

3.Fibroblastscontributetomelanomatumorgrowthanddrugresistance. FlachEH,RebeccaVW,HerlynM,SmalleyKS,AndersonAR.Molecular pharmaceutics2011;doi:10.1021/mp200421k

從1985年至今的30多年時間里，PCR分析經(jīng)歷了三代技術(shù)的發(fā)展。DY代傳統(tǒng)PCR技術(shù)，采用瓊脂糖凝膠電泳的方法對PCR產(chǎn)物進(jìn)行定性分析。第二代熒光定量PCR技術(shù)，通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累實時監(jiān)控PCR進(jìn)程，ZH用Cq值對基因進(jìn)行定量分析。第三代數(shù)字PCR技術(shù)，通過將PCR反應(yīng)液進(jìn)行有限稀釋，實現(xiàn)核酸分子的單分子擴增，ZZ采取終點法檢測陽性微滴的熒光信號，有熒光信號的微滴判讀為 1；沒有熒光信號的微滴判讀為 0，因此該技術(shù)被稱為數(shù)字PCR。

PCR技術(shù)在不斷地蛻變卻從未淡出我們的視野，如今已經(jīng)滲透到分子生物學(xué)領(lǐng)域的各種研究層面。尤其在今年大流行疾病中，展現(xiàn)了PCR技術(shù)的強大之處。那在科學(xué)研究中，我們該如何選擇傳統(tǒng)PCR 、熒光定量 PCR與數(shù)字 PCR呢？

首先我們要清楚，三代PCR技術(shù)所有的基礎(chǔ)源于PCR反應(yīng)的基本原理和PCR反應(yīng)的3個重要階段，分別是指數(shù)期、線性期和平臺期。

指數(shù)期

指數(shù)期內(nèi)，每個循環(huán)PCR產(chǎn)物量大約增加1倍（假定 100%反應(yīng)效率），該階段的擴增反應(yīng)具有高度特異性和精確度。

線性期（高變異性）

隨著PCR反應(yīng)體系成分的消耗，其中的一個或者多種成分限制反應(yīng)，導(dǎo)致反應(yīng)開始減緩，并且每個循環(huán)的PCR 產(chǎn)物不再加倍。

平臺期

反應(yīng)停止，不再產(chǎn)生更多的產(chǎn)物。因為每個樣品具有不同的反應(yīng)動力學(xué)，所以每個反應(yīng)將在不同的時間點進(jìn)入平臺期，平臺期內(nèi)可以看到這些差異。

傳統(tǒng) PCR

傳統(tǒng)PCR通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR終產(chǎn)物進(jìn)行分析（圖2），它的局限性就在于只能做定性分析。在圖3中，3個反應(yīng)孔含有相同量的 DNA模板，但到達(dá)平臺期后產(chǎn)生的熒光信號卻不同，說明擴增產(chǎn)物的量存在不同（反應(yīng)動力學(xué)變化所致）。這也表明了傳統(tǒng)PCR平臺期測量時結(jié)果存在變異，產(chǎn)出的DNA量不一定能反映最初情況，所以無法進(jìn)行定量。

熒光定量 PCR

同樣在圖3中，發(fā)現(xiàn)在指數(shù)期內(nèi)，3個反應(yīng)孔的擴增曲線完全重合，說明指數(shù)期內(nèi)進(jìn)行檢測將更加精確，可實現(xiàn)更加準(zhǔn)確的定量。閾值線是擴增產(chǎn)物熒光強度超過背景時的一個熒光強度值，樣品達(dá)到此熒光強度值所經(jīng)過的循環(huán)數(shù)稱為Cq值。通過比較未知濃度的樣品與一系列標(biāo)準(zhǔn)品的Cq值，可以精確測定未知反應(yīng)中的模板 DNA數(shù)量。

數(shù)字 PCR

數(shù)字 PCR 是通過將樣本DNA隨機分布至獨立的反應(yīng)單元中，每個反應(yīng)單元中包含或者不包含1個或多個拷貝的目標(biāo)分子，所有獨立的反應(yīng)單元進(jìn)行平行擴增后，對每個反應(yīng)單元的陰性或者陽性熒光信號進(jìn)行檢測并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，就可以計算出原始樣本的拷貝數(shù)，無需參考標(biāo)準(zhǔn)品或內(nèi)源性對照品，也不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線。

傳統(tǒng)PCR 、熒光定量 PCR與數(shù)字 PCR的選擇

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參考文獻(xiàn)：

1. Sykes PJ, Neoh SH, Brisco MJ, Hughes E, Condon J, Morley AA. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 1992;13(3):444-449.

2. Vogelstein B , Kinzler K W . Digital PCR[J]. Proceedings of the National Academy of ences of the United States of America, 1999, 96(16):9236-9241.

3. Heyries KA, Tropini C, Vaninsberghe M, et al. Megapixel digital PCR. Nat Methods. 2011;8(8):649-651.

4. Dingle TC, Sedlak RH, Cook L, Jerome KR. Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clin Chem. 2013;59(11):1670-1672.

5. Whale AS, Huggett JF, Cowen S, et al. Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation. Nucleic Acids Res. 2012;40(11):e82.

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數(shù)字萬用表對于所有的電子電力工程師來說，肯定都再熟悉不過了。數(shù)字多用表（DMM）就是在電氣測量中要用到的電子儀器。它可以有很多特殊功能，但主要功能就是對電壓、電流、電阻和通斷等電氣參數(shù)進(jìn)行測量。作為現(xiàn)代化的多用途電子測量儀器，主要用于電氣維護(hù)、設(shè)備檢修、研發(fā)測試等應(yīng)用領(lǐng)域。

那么在選擇一款數(shù)字萬用表時，我們首先應(yīng)該考慮哪些關(guān)鍵指標(biāo)呢？今天Agitek就簡單給大家分享一下：

1、測試原理

數(shù)字萬用表測試的原理有兩種：平均響應(yīng)和真有效值這兩種測試方法分別對應(yīng)不同類型的電氣信號測試。對于直流信號或標(biāo)準(zhǔn)正弦波來講，不管是真有效值還是平均響應(yīng)的儀表都能準(zhǔn)確測量；但是對于含畸變波形的信號，或典型的非正弦波如方波、三角波、鋸齒形波，只有真有效值儀表才能準(zhǔn)確測量。

2、帶寬

帶寬是數(shù)字萬用表在精度范圍內(nèi)，所能響應(yīng)的交流頻率范圍。它不是測量頻率的功能，而是反映交流頻率響應(yīng)的能力，若被測信號頻率超過了萬用表的交流帶寬，萬用表將不能在頻率響應(yīng)范圍內(nèi)正確測量交流值。舉例：Fluke115C萬用表測試頻率的量程是50KHZ，但是帶寬是500HZ。這意味著當(dāng)使用F115C測試信號的頻率參數(shù)時，Z高可達(dá)50KHZ。但是當(dāng)被測信號頻率超過500HZ時，如果使用F115C測試信號的電壓/電流參數(shù)，測試結(jié)果則會有較大誤差，所以應(yīng)選擇合適帶寬的表來測試相應(yīng)的信號

3、量程

量程是指儀表在當(dāng)前檔位所能夠測試的Z大值。要根據(jù)被測信號值的范圍來選擇合適的量程，福祿克萬用表均為手動/自動量程一體，方便用戶自由切換。在選擇數(shù)字萬用表時，要根據(jù)實際測試的需求來選擇合適量程的表。

4、顯示位數(shù)及分辨率

顯示位數(shù)：萬用表能夠顯示的字?jǐn)?shù)范圍。通常，將能夠顯示從0-9中所有數(shù)字的位數(shù)成為整位數(shù)，其它統(tǒng)稱為半位。舉例：Fluke15B+的顯示位數(shù)是3999，只有三個位置上可以顯示全0-9，Z高位只能顯示0-3，則稱其為三位半的表。 而Fluke87-VC的顯示位數(shù)是19999，有四個位置上可以顯示全0-9，Z高位只能顯示0-1，則稱其為四位半的表。分辨率：描述可被識別的物理量的Z小變化。萬用表半位上顯示數(shù)字的高低和萬用表顯示位數(shù)的大小決定了一些特定讀數(shù)時的分辨率。顯示位數(shù)越大，則儀表測試時的分辨率會越高。舉例：Fluke15B+的顯示位數(shù)是3999，F(xiàn)luke115C的顯示位數(shù)為5999，F(xiàn)luke287C的顯示位數(shù)為49999。如果當(dāng)前被測電壓的實際值為402.6V，則Fluke15B+則會顯示402V，可分辨1V級別信號的變化。Fluke115C則會顯示402.6V，可分辨0.1V級別信號的變化。而Fluke287C則會顯示402.60V，可分辨0.01V級別信號的變化。

5、其它特殊功能

其他功能如低通濾波器、雙阻抗輸入、溫度等附屬功能，應(yīng)根據(jù)實際測試需求及被測信號的類型來合理選擇。

工欲善其事，必先利其器！因此，在選型階段應(yīng)根據(jù)實際被測信號的類別及對要求來選擇合適的工具應(yīng)對，一款Z合適的數(shù)字萬用表才能助您使命必達(dá)。以上內(nèi)容由安泰測試整理，安泰測試為客戶提供選型、銷售、培訓(xùn)、維修等一站式服務(wù)，如需樣機SY或者演示服務(wù)，歡迎咨詢安泰測試。