全封閉Naica數(shù)字PCR新型冠狀病毒超敏檢測方案

Cycloud與MicroFuture合作

深藍(lán)云生物科技與北京微未來科技，基于國家疾控ZX和WHO推薦區(qū)域，針對2019新型冠狀病毒的四段保守序列作為檢測靶標(biāo)，開發(fā)超敏的數(shù)字PCR檢測方法和快速的定量PCR檢測方法。

【圖源：北京微未來科技】

區(qū)段分別為：RdRP基因（特異性靶點(diǎn)），E蛋白基因，N蛋白基因，保守基因S區(qū)位點(diǎn)。確保對2019新型冠狀病毒鑒定的高度特異性和靈敏度。      

與人冠狀病毒HcoV-229E、 HcoV-HKU1、 HcoV-OC43、 HcoV-NL63等型無交叉。

深藍(lán)云生物科技以專業(yè)服務(wù)科學(xué)為使命，愿所學(xué)，以致用，共戰(zhàn)病毒！

北京微未來科技有限公司以“解碼病原微生物，致力于傳染病防控”為企業(yè)使命。與北京深藍(lán)云生物科技共同在病毒的超敏檢測的數(shù)字PCR方法展開深入合作。 

聯(lián)系方式：

公司名稱：北京深藍(lán)云生物科技有限公司
聯(lián)系電話：010-57256059
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法國Stilla Technologies公司開發(fā)的—款多重PCR專用預(yù)混液：naica^?multiplex PCR MIX（見表1），專用于naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的多重檢測。并對naica^?multiplex PCR MIX的多重檢測性能進(jìn)行了詳細(xì)評估。當(dāng)面對有限的樣本量時(shí)，可保證多重?cái)?shù)字PCR檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性；在復(fù)雜背景基因存在的情況下，依然能精確檢出低豐度的目的基因。

★ naica^?multiplex PCR MIX在naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR上進(jìn)行6個(gè)靶標(biāo)的同步準(zhǔn)確定量

采用0.2~13000cp/ul的DNA樣品，使用10X naica^?multiplex PCR MIX在naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)上進(jìn)行6個(gè)靶標(biāo)的線性范圍分析，結(jié)果顯示6個(gè)靶標(biāo)的R²均＞0.99，說明在naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)上，能夠可靠地實(shí)現(xiàn)6靶標(biāo)同步準(zhǔn)確定量（圖1)。與2X和5X濃度的數(shù)字PCR預(yù)混液(dPCR Mixes)相比，10X濃度的數(shù)字PCR預(yù)混液體積加入量降低了50％至80％，最大限度地提高樣品加入量。尤其是在檢測低濃度樣品或稀有靶標(biāo)時(shí)，樣品加入量的增加可提高檢測靈敏度。

▲ 圖1：使用naica^?multiplex PCR MIX在naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR上進(jìn)行6個(gè)靶標(biāo)的線性分析，分別在藍(lán)色、青色、綠色、黃色、紅色和紅外線6個(gè)通道進(jìn)行檢測。每個(gè)稀釋點(diǎn)的DNA濃度分別為：0.2、1.5、8.0、50、320、2050和13000 cp/ul，每個(gè)稀釋度進(jìn)行3次重復(fù)。結(jié)果顯示6個(gè)靶標(biāo)的R2均大于0.99，說明所有靶標(biāo)的結(jié)果都高度真實(shí)可靠。

★ 在復(fù)雜的背景基因下，對低豐度目的基因進(jìn)行精確定量

數(shù)字PCR的—個(gè)重要技術(shù)優(yōu)勢是能夠在存在多個(gè)靶標(biāo)擴(kuò)增的情況下檢測到低濃度靶標(biāo)。為了評估naica^?multiplex PCR MIX的穩(wěn)定性。使用同一個(gè)目標(biāo)DNA模板的不同濃度系列稀釋液（0.2~ 13000 cp/uL)進(jìn)行檢測，同時(shí)其中摻入5種外部靶標(biāo)模板（每個(gè)靶標(biāo)的濃度為3000 cp/ul)。在不同測試條件下，結(jié)果均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖2A和2C)。這些結(jié)果與同一DNA 靶點(diǎn)在不同濃度下單獨(dú)檢測以及在不添加外部靶標(biāo)的情況下獲得的結(jié)果具有可比性（圖2B和2D）。

▲ 圖2：使用naica^?multiplex PCR MIX的擴(kuò)增結(jié)果真實(shí)可靠。將pUC18質(zhì)粒（圖A和B)和pUC57質(zhì)粒（圖C和D)的13000至0.2 cp/ul的系列稀釋液在5個(gè)外部擴(kuò)增靶標(biāo)背景下（每個(gè)靶標(biāo)為3000 cp/ul(A,C)）和在不含外部靶標(biāo)(B,D)的情況下進(jìn)行定量檢測，3次重復(fù)。線性擬合系數(shù) R2>0.99，表明在不考慮多重背景的情況下，對所有靶標(biāo)的測定結(jié)果都是真實(shí)可靠的。5個(gè)外部靶標(biāo)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差保持在2.3％至3.1% (n=21)，顯示出極好的重復(fù)性。

★ naica^?multiplex PCR MIX應(yīng)用亮點(diǎn)

?  實(shí)現(xiàn)數(shù)字PCR方法多重檢測的高度穩(wěn)定性和高檢測靈敏度；

?  可在naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)同時(shí)定量檢測6個(gè)獨(dú)立的DNA靶標(biāo)，均具有良好線性關(guān)系；

?  5X和10X的數(shù)字PCR預(yù)混液，提高了naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)高階多重檢測能力；

?  10X PCR MIX比5X PCR MIX降低50％的體積用量，從而增加DNA的加入量。在檢測低濃度樣品或稀有靶標(biāo)時(shí)，樣本加入量的增加可提高檢測靈敏度。

表1 naica^?multiplex PCR MIX貨號(hào)及規(guī)格

naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國Stilla Technologies公司naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片式數(shù)字PCR技術(shù)，自動(dòng)化微滴生成和擴(kuò)增，每個(gè)樣本孔可實(shí)現(xiàn)6熒光通道的檢測，智能化識(shí)別微滴并進(jìn)行質(zhì)控，3小時(shí)內(nèi)即可獲得至少6個(gè)靶標(biāo)基因的拷貝數(shù)濃度。