光片熒光顯微鏡簡(jiǎn)介
光片熒光顯微鏡（LSFM）是一種快速發(fā)展的體積成像技術(shù)，因其速度快、靈敏度高、光學(xué)分層能力強(qiáng)以及低光毒性和低光漂白而受到生命科學(xué)家的青睞。在LSFM中，生物標(biāo)本被聚焦的光片照亮，熒光通過(guò)現(xiàn)代科學(xué)相機(jī)以寬視場(chǎng)格式捕獲。與傳統(tǒng)的表面熒光成像方法不同，LSFM限制了對(duì)焦區(qū)域以外的潛在有害照明，從而減少了光毒性和光漂白，提高了成像對(duì)比度。
在《Systematic and Quantitative Comparison of Lattice and Gaussian Light-Sheets》一文中，作者Bo-Jui Chang、Kevin M. Dean和Reto Fiolka 系統(tǒng)比較了基于不同光束光片的物理性質(zhì)。盡管近年來(lái)新的光束因其窄光腰和傳播不變特性受到關(guān)注，但關(guān)于其物理性質(zhì)及其與標(biāo)準(zhǔn)高斯光束相比的研究卻很少。本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)量了最常用的方形光柵光片和高斯光片的光束特性，發(fā)現(xiàn)兩者在厚度、共焦參數(shù)、傳播長(zhǎng)度和整體成像性能方面非常相似。本文旨在對(duì)這些研究結(jié)果進(jìn)行解讀，明確其對(duì)光片熒光顯微鏡（LSFM）領(lǐng)域的研究人員和實(shí)踐者的影響。
關(guān)鍵概念和方法
這篇文章重點(diǎn)討論了兩種主要的光片類型：高斯光束和常用于LLSM的抖動(dòng)方格光柵(dithered square lattice)。作者詳細(xì)介紹了生成和分析這些光片的實(shí)驗(yàn)設(shè)置，包括使用488納米激光器、空間光調(diào)制器以及各種光學(xué)元件來(lái)成形和測(cè)量光片。
圖1.由方形光柵和高斯光片照明的3D圖像堆疊中的珠子在YX和YZ最大強(qiáng)度投影（MIP），傳播長(zhǎng)度分別為(A) 12 μm, (B) 19 μm, (C) 32 μm 和 (D) 40 μm。
表格1. 方形光柵和高斯光片的橫向和軸向分辨率是通過(guò)100納米熒光納米球測(cè)量的。使用雙樣本T檢驗(yàn)評(píng)估統(tǒng)計(jì)顯著性。
在40um 傳播長(zhǎng)度處，高斯光束表現(xiàn)出更好的軸向分辨率。
光片特性的比較
01
光束厚度和傳播長(zhǎng)度
研究表明，高斯光片和方格光柵光片在光束腰厚度和傳播長(zhǎng)度方面表現(xiàn)出相似的特性。這一發(fā)現(xiàn)具有重要意義，因?yàn)樗?strong>挑戰(zhàn)了之前認(rèn)為光柵光片由于其傳播不變性而具有更優(yōu)越的軸向分辨率的觀點(diǎn)。
圖2. 高斯光片和方形光片顯微鏡的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù) (PSF) 和光學(xué)傳遞函數(shù) (OTF)。(A) 數(shù)值孔徑 (NA) 為 0.31、0.24 和 0.14 的高斯光片，以及數(shù)值孔徑為 0.70 和 0.56、0.55 和 0.44、0.35 和 0.28 的方形光片的光束輪廓。展示了 YZ 和 XZ 的橫截面視圖。每個(gè)光片在中心（最薄的腰部）的 XZ 視圖。箭頭指向有用光片邊緣和方形光片旁瓣的不同之處。NA：用于方形光片的環(huán)形外數(shù)值孔徑；na：用于方形光片的環(huán)形內(nèi)數(shù)值孔徑。(B) 沿傳播方向的光束大小測(cè)量。(C) 光片厚度的測(cè)量。
02
光學(xué)性能
作者細(xì)致地測(cè)量了兩種光片的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）和光學(xué)傳遞函數(shù)（OTF）。
圖3. 方形光柵和高斯光片顯微鏡的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）和光學(xué)傳遞函數(shù)（OTF）。所有PSF和OTF圖像均應(yīng)用了0.8的伽馬校正，以增加弱特征的對(duì)比度。選擇具有類似共焦參數(shù)的高斯光片以與光柵光片進(jìn)行比較。PSF的比例尺為1 μm。
結(jié)果表明，高斯光片和方格光柵光片具有相似的PSF和OTF，表明它們?cè)趯?shí)際應(yīng)用中的成像性能幾乎沒(méi)有區(qū)別。
03
共焦參數(shù)
兩種光片在光片厚度與共焦參數(shù)之間表現(xiàn)出相似的關(guān)系。然而，由于生成和調(diào)節(jié)這些光束的復(fù)雜性，方格光柵光片表現(xiàn)出略大的可變性。
圖4. (A) 光片厚度與光片傳播長(zhǎng)度的關(guān)系。厚度的測(cè)量方法如圖1(C)所述，傳播長(zhǎng)度的測(cè)量方法如圖1(D)所述。(B) 光片厚度與共焦參數(shù)的關(guān)系。共焦參數(shù)的測(cè)量方法見(jiàn)原文。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
研究表明，大多數(shù)LLSM實(shí)驗(yàn)可以使用傳統(tǒng)的高斯光片完成，從而簡(jiǎn)化了系統(tǒng)的組裝、對(duì)準(zhǔn)和操作。此外，使用高斯光片所需的激光輸入功率更少，并且更容易實(shí)現(xiàn)多色同時(shí)激發(fā)。研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了線性光學(xué)中的基本物理定律，即隨著共焦參數(shù)的增加，光片厚度和旁瓣強(qiáng)度也會(huì)增加。
圖5. 寬場(chǎng)、高斯光片顯微鏡和方形光柵光片顯微鏡的PSF和OTF。為了增強(qiáng)弱特征的對(duì)比度，所有PSF和OTF圖像均應(yīng)用了0.5的伽馬校正。沿OTF中心虛線的剖面圖（未進(jìn)行伽馬校正）清晰顯示了OTF的支持范圍。PSF中的比例尺為1 μm。
實(shí)踐意義
研究結(jié)論表明，對(duì)于大多數(shù)LLSM應(yīng)用，傳統(tǒng)的高斯光片與方格光柵光片的性能相當(dāng)。這對(duì)LSFM系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和使用具有實(shí)際意義，表明無(wú)需復(fù)雜的光柵配置，使用更簡(jiǎn)單、更直觀的高斯光片即可實(shí)現(xiàn)類似的結(jié)果。
本文為熒光顯微技術(shù)領(lǐng)域做出了重要貢獻(xiàn)，提供了清晰且數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的比較，可以指導(dǎo)未來(lái)光片成像技術(shù)的研究和發(fā)展。
參考文獻(xiàn)：
Chang, B-J., Dean, K. M., & Fiolka, R. (2020). Systematic and quantitative comparison of lattice and Gaussian light-sheets. Optics Express, 28(18), 27052-27065. DOI: 10.1364/OE.400164
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