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顯微課堂 | 線蟲(chóng)研究指南-針對(duì)線蟲(chóng)的相關(guān)工作

來(lái)源:徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司 更新時(shí)間:2026-04-11 11:30:35 閱讀量:68
導(dǎo)讀:顯微課堂 | 線蟲(chóng)研究指南-針對(duì)線蟲(chóng)的相關(guān)工作


利用顯微鏡推動(dòng)發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、衰老和神經(jīng)科學(xué)與elegans(線蟲(chóng))的發(fā)展

本指南概述了可以高效進(jìn)行線蟲(chóng)研究的顯微鏡技術(shù)。線蟲(chóng)是一種廣泛使用的模式生物,與人類有大約70%的基因同源性,是研究發(fā)育、神經(jīng)科學(xué)、遺傳學(xué)和衰老的理想生物。它的透明性和易培育性使其成為一個(gè)出色的遺傳學(xué)模型系統(tǒng)。它可以進(jìn)行高分辨率成像。主要的實(shí)驗(yàn)方法包括揀蟲(chóng)、轉(zhuǎn)基因、熒光篩選、成像和記錄。


顯微鏡和線蟲(chóng)研究


顯微鏡是研究線蟲(chóng)的必備工具。在這些步驟中都會(huì)用到它們:

1

“揀蟲(chóng)”:用金屬挑針從瓊脂平板上挑出蟲(chóng)子,轉(zhuǎn)移到新的平板上進(jìn)行培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)。

2

通過(guò)向線蟲(chóng)體內(nèi)顯微注射核酸進(jìn)行轉(zhuǎn)基因(基因改造)。

3

熒光篩選,鑒定表達(dá)轉(zhuǎn)染熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因線蟲(chóng)。

4

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)線蟲(chóng)(從胚胎到成蟲(chóng)的所有階段)進(jìn)行成像和記錄。

這些任務(wù)通過(guò)體視顯微鏡、復(fù)合顯微鏡或共聚焦顯微鏡來(lái)完成。

來(lái)自秀麗隱桿線蟲(chóng)的細(xì)胞表達(dá)熒光蛋白SPD5-GFP(指示中心體標(biāo)記,綠色)和Histon 2B-Cherry(指示細(xì)胞核,紅色)。間期細(xì)胞中的兩對(duì)中心體用白色箭頭標(biāo)出。該圖像是經(jīng)過(guò)ICC(即時(shí)計(jì)算去噪)和SVCC(小體積計(jì)算去噪)處理后的Z-stack的最大投影。


揀蟲(chóng)


要“挑選”具有適當(dāng)表型或轉(zhuǎn)基因的個(gè)體秀麗隱桿線蟲(chóng),或?qū)⒕€蟲(chóng)從一個(gè)平板移到另一個(gè)平板,研究人員需要使用立體顯微鏡和一個(gè)末端帶有金屬尖端的小工具。


與揀蟲(chóng)有關(guān)的挑戰(zhàn)有:

對(duì)比度不夠好時(shí),難以識(shí)別線蟲(chóng)的關(guān)鍵解剖細(xì)節(jié)。

長(zhǎng)時(shí)間揀蟲(chóng)會(huì)造成用戶疲勞。

用工具處理線蟲(chóng)時(shí),顯微鏡物鏡下沒(méi)有足夠的空間。

視野不夠大時(shí),找蟲(chóng)子很麻煩。


不過(guò),徠卡顯微鏡具有以下優(yōu)勢(shì),可以克服這些挑戰(zhàn):

配備各種對(duì)比方法的透射光底座可實(shí)現(xiàn)高光學(xué)對(duì)比度,從而觀察到蟲(chóng)體細(xì)節(jié)。

采用人體工程學(xué)模塊,用戶安裝舒適,減少勞累和疲勞。

物鏡下方空間充足,工作距離可達(dá)122毫米。

視野更大,更容易發(fā)現(xiàn)線蟲(chóng)。

瓊脂板上有很多秀麗隱桿線蟲(chóng),就像在挑蟲(chóng)時(shí)可能會(huì)看到的那樣。


顯微注射轉(zhuǎn)基因


秀麗隱桿線蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因通常是通過(guò)核酸顯微注射完成的。顯微注射通常使用配有注射裝置的倒置復(fù)合顯微鏡進(jìn)行。


對(duì)線蟲(chóng)進(jìn)行顯微注射面臨著一些挑戰(zhàn):

對(duì)比度不足,無(wú)法觀察到線蟲(chóng)的精細(xì)解剖細(xì)節(jié),而這正是進(jìn)行適當(dāng)靶向定位所必需的。

沒(méi)有足夠的空間使用微型注射器。

設(shè)置不穩(wěn)定時(shí)振動(dòng)太大。


為了克服這些挑戰(zhàn),用戶可以利用徠卡顯微鏡提供的優(yōu)勢(shì):

光學(xué)對(duì)比方法,如DIC(微分干涉對(duì)比)或IMC(集成調(diào)制對(duì)比),可清楚地看到注入線蟲(chóng)的位置。

抗震裝置(防震裝置)穩(wěn)定可靠。

能夠使用精確的操作器(Narishige或Eppendorf)進(jìn)行微量注射。

表達(dá)GFP(綠色熒光蛋白)的轉(zhuǎn)基因秀麗隱桿線蟲(chóng)。Thunder的圖像由中南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的L. Ma提供。


熒光篩選


要找到轉(zhuǎn)基因成功的秀麗隱桿線蟲(chóng),需要使用立體顯微鏡進(jìn)行熒光篩選。


線蟲(chóng)熒光篩選存在一定的挑戰(zhàn):

熒光信號(hào)暗淡,難以觀察熒光轉(zhuǎn)基因。

老線蟲(chóng)蟲(chóng)和瓊脂發(fā)出強(qiáng)烈的自發(fā)熒光。

由于視野較小,難以發(fā)現(xiàn)線蟲(chóng),導(dǎo)致篩查時(shí)間延長(zhǎng)。


使用徠卡顯微鏡可以通過(guò)以下方式克服這些篩選難題:

采用三光束技術(shù)的獨(dú)立激發(fā)通道提高了信噪比,適用于體視顯微鏡。

使用專門設(shè)計(jì)的反射鏡防止自發(fā)熒光,反射鏡可與Leica透射光底座一起使用。

徠卡透射光底座提供大視場(chǎng)和多種對(duì)比方法。

一張成年雌雄同體秀麗隱桿線蟲(chóng)的Thunder拍攝的圖像,展示了其性腺。該線蟲(chóng)用以下熒光染料進(jìn)行了染色:DAPI(藍(lán)色)指示細(xì)胞核,SP56(綠色)指示精子,RME-2(紅色)指示卵母細(xì)胞,PGL-1(洋紅色)指示RNA和蛋白質(zhì)顆粒。圖片由德國(guó)哈勒馬丁路德大學(xué)的C. Eckmann提供。


成像和文件


在篩選和鑒定轉(zhuǎn)基因秀麗隱桿線蟲(chóng)標(biāo)本后,高分辨率成像和精確記錄對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析至關(guān)重要。要實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo),需要顯微鏡配備高質(zhì)量的攝像頭或探測(cè)器以及兼容的成像軟件。


線蟲(chóng)成像和記錄方面的主要挑戰(zhàn)是:

由于光散射的原因,在對(duì)線蟲(chóng)更深處的結(jié)構(gòu)成像時(shí)會(huì)出現(xiàn)焦外模糊的現(xiàn)象。

避免光和熱對(duì)線蟲(chóng)造成傷害。

利用基因編碼報(bào)告器觀察活體線蟲(chóng)的暗淡熒光(包括延時(shí)成像)。


使用徠卡顯微鏡可以克服這些挑戰(zhàn)。優(yōu)勢(shì)如下:

利用圖像增強(qiáng)功能,將線蟲(chóng)深處的細(xì)節(jié)可視化。

使用高質(zhì)量的光學(xué)元件、適當(dāng)?shù)恼彰鞴庠春挽`敏的相機(jī)/探測(cè)器,減少光照射,降低對(duì)線蟲(chóng)的傷害。

利用寬場(chǎng)顯微鏡和高靈敏度顯微攝像機(jī)的良好單噪比,促進(jìn)實(shí)時(shí)成像。

必要時(shí),使用轉(zhuǎn)盤、共聚焦或光片顯微鏡獲取更高分辨率的三維圖像。

研究秀麗隱桿線蟲(chóng)的神經(jīng)系統(tǒng):使用徠卡共聚焦顯微鏡拍攝的表達(dá)熒光蛋白CFP(青色)、GFP(綠色)、YFP(黃色)和DsRed(紅色)的線蟲(chóng)圖像。


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徠卡顯微系統(tǒng)(Leica Microsystems)是德國(guó)著名的光學(xué)制造企業(yè)。具有175年顯微鏡制造歷史,現(xiàn)主要生產(chǎn)顯微鏡, 用戶遍布世界各地。早期的“Leitz”顯微鏡和照相機(jī)深受用戶愛(ài)戴, 到1990年徠卡全部產(chǎn)品統(tǒng)一改為“Leica”商標(biāo)。徠卡公司是集顯微鏡、圖像采集產(chǎn)品、圖像分析軟件三位一體的顯微鏡生產(chǎn)企業(yè)。

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