疫苗研發(fā)、基因治療、生物制藥、細胞治療、抗病毒藥物與診斷試劑——EVOS M7000智能成像系統(tǒng)為病毒滴度檢測精準護航，加速創(chuàng)新轉(zhuǎn)化！

優(yōu)點包括減少資源消耗（時間、資金和材料方面），實現(xiàn)自動化和高通量分析，以及提高精度和準確性。圖示部分展示了傳統(tǒng)的 ICC 方法，包含一個雙結(jié)合抗體系統(tǒng)，需要依次進行給藥并手動獲取圖像和分析，這是一種低效率的方法，圖像采集和分析所需的時間會隨著數(shù)據(jù)點數(shù)量的增加而呈指數(shù)級增長。

一步法方案涵蓋了所提出的優(yōu)化方法，包括單抗系統(tǒng)、自動化圖像采集以及大規(guī)模批量分析。這是一種高通量的方法，能夠及時獲取并分析大量數(shù)據(jù)，從而實現(xiàn)更精確和可重復的病毒定量。需要指出的是，每個箭頭代表了重復進行的洗滌步驟，這也極大地增加了執(zhí)行病毒定量過程所需的時間。該圖像由 BioRender 創(chuàng)建。

將 A549 細胞以 100 倍感染量感染 Ad5D24 細菌 48 小時后進行成像。采用核染色方法結(jié)合 FITC 單體系統(tǒng)，以實現(xiàn)更精確的滴度測定過程，并通過核染色劑 Hoechst（作為總細胞數(shù)的估計值）和 FITC（作為總感染數(shù)的估計值）來確定感染率。 （A）基于顯微鏡通道的采集數(shù)據(jù)解析，將多通道整管圖像分離到各自的通道中。通過 EVOS 分析軟件，可以對每種熒光染色劑的計數(shù)進行獲取。（B）單通道分析涉及通過公式 2（方法說明）對目標計數(shù)進行操作，并與總體細胞計數(shù)進行比較，從而創(chuàng)建感染百分比指標。從整個孔圖像中，通過公式 2 可以確定高度準確的感染滴度。（C）該儀器的其他可量化指標包括每個斑點的強度、圓度和面積，所有這些都提供了有關(guān)這些目標的感染狀態(tài)的重要信息。圖像通過 EVOS M7000 成像系統(tǒng)在手動采集操作規(guī)程下獲取（每孔 40 張圖像，每種條件 3 個重復孔）。統(tǒng)計學分析為常規(guī)的一元方差分析，各孔之間的標準差已給出。所示的是平均值±標準誤，顯著性水平設定為 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001 和 ****p < 0.0001（95%置信區(qū)間）。

使用 M7000 成像系統(tǒng)在 10 倍放大倍數(shù)下，對整個標準的 24 孔板（每種條件 3 個重復孔）進行同時成像，采用自動采集操作規(guī)程。每個通道生成的拼接圖像分別進行處理，并在單個通道級別上進行分析。從孔邊緣（細胞融合度低于 50%）捕獲的圖像被排除在分析之外。通過 EVOS 分析和 Celleste 6.0軟件 的聯(lián)合應用，對圖像進行分析，包括病毒滴度的測定。進行的統(tǒng)計分析為普通的一元方差分析，并報告了標準差。所示的是平均值±標準誤以及在孔之間設定的顯著性水平：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001（置信區(qū)間 95%）。

基于多通道獲取圖像的高效方法，可按時間順序可視化分析其在病毒感染后的擴散情況。在腺病毒中，監(jiān)測感染后的前 72 小時對于了解感染的關(guān)鍵時間點具有重要意義，這對所有后續(xù)應用和實驗非常有益。將優(yōu)化的方案與 EVOS M7000 成像系統(tǒng)相結(jié)合，使這項任務變得非常簡單。病毒感染的首次出現(xiàn)跡象在 24 小時后明顯顯現(xiàn)，所有標記通道的信號顯著增加，分別記錄的平均計數(shù)為 RFP 38.06、FITC 38.15 和抗 Hexon 傳輸 40.12（圖 4B）。所得的熒光強度在不同時間點上呈現(xiàn)出穩(wěn)定的增加趨勢，在 48 小時時分別達到 RFP 和 FITC 熒光指示劑的平均最大值 1762.58 和 497.73L/mm（圖 4A 和 4C）。在 72 小時時間點，由于細胞從板上脫落和細胞溶解，出現(xiàn)了顯著的下降。隨后的圖像分析顯示了感染細胞計數(shù)、強度的相同趨勢。并且目標的循環(huán)性表現(xiàn)為首次出現(xiàn)的時間為 24 小時，在 48 小時時觀察到最大效果，隨后在 72 小時出現(xiàn)顯著下降（圖 4B 和 4C）。在進一步計算的值中，包括目標的面積、滴度和總體感染率（圖 4B），總體趨勢保持不變。綜合來看，這種新的一步法方法能夠與以前的方法相比，為腺病毒感染后的最初 72 小時提供了更深入和準確的數(shù)據(jù)。

在 96 孔板上重復進行了相同的實驗，以充分利用該容器的固有優(yōu)勢（所需試劑量較少，可分配更多孔位以設置更多時間點，經(jīng)濟上更劃算），從而能夠獲得更多的時間點，以便更清晰地闡明病毒復制周期的各個階段。

為了具體說明這種方法在正常細胞中對傳染性的適用性，我們使用了 Ad5ddTomato 對 Hek293 細胞進行感染的實驗。在 96 孔板上重復實驗獲得了相似的數(shù)據(jù)和趨勢，能夠準確地在整個復制周期內(nèi)定量非腫瘤溶解型病毒（圖 S1B）。這一點通過轉(zhuǎn)基因得到了體現(xiàn)。在 24 小時時達到生產(chǎn)峰值，第 4 天達到最大信號強度，而到第 5 天（即病毒復制周期結(jié)束時）信號強度則顯著下降（圖 7）。

根據(jù)文獻中的標準間隔獲取多通道圖像，以追蹤 Ad5D24 病毒感染（100 MOI）在 A549 細胞中的擴散情況。（A）在標準 24 孔培養(yǎng)皿中獲得的完整圖像集，報告了 DAPI、GFP、RFP 和透射（Trans）通道的圖像，并展示了所有這些通道的代表性疊加圖像。這些圖像使用 EVOS M7000 成像系統(tǒng)在自動采集中獲?。靠?40 張圖像，每個條件 3 個重復孔）。（B）通過顯微鏡成像分析獲得的指標，展示了病毒的進展情況。使用 EVOS 分析軟件對每種熒光染色物進行計數(shù)（C）通過使用（B）中先前獲取的指標以及材料與方法部分所討論的后續(xù)方程進行計算，獲得了更多有關(guān)病毒感染的測量數(shù)據(jù)。章節(jié)。所進行的統(tǒng)計分析為常規(guī)的雙因素方差分析，各孔之間的標準差予以報告。所示內(nèi)容為平均值±標準誤，顯著性水平設定為*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001 和 ****p < 0.0001（置信區(qū)間 95%）。

通過與圖 4 中所描述的相同方法獲取了多通道圖像，并針對該容器的較大容量增設了額外的時間點。（A）在 96 孔容器中獲得的完整圖像集，報告了在 DAPI、GFP、RFP 和透射通道中獲取的圖像，并配有相應的疊加圖。這些圖像使用 EVOS M7000 成像系統(tǒng)在自動采集程序下獲?。靠?10 張圖像，每個條件 5 個重復孔）。

根據(jù)文獻中的規(guī)定，在關(guān)鍵時間點獲取多通道圖像，以追蹤 Ad5ddTomato 這種非腫瘤病毒的感染擴散情況。 （A）在標準 24 孔培養(yǎng)皿中獲得的完整圖像集，報告了 DAPI、GFP、RFP 和透射通道所獲取的圖像，以及所有這些通道的代表性疊加圖像。這些圖像使用 EVOS M7000 成像系統(tǒng)在自動采集程序下獲取（每孔 40 張圖像，每個條件 3 個重復孔）。

使用低容量和高容量容器評估 Ad5D24 病毒對 A549 細胞的感染能力（100 MOI，持續(xù) 48 小時）時所獲得的準確度測量值。

（A）低容量和高容量容器中培養(yǎng)皿相對表面積的示意圖，該示意圖在五張圖像中呈現(xiàn)，分別記錄了低容量和高容量容器的數(shù)據(jù)。通過容器制造商的規(guī)格（24 孔，1.93 平方厘米；96 孔，0.33 平方厘米）計算出的培養(yǎng)皿表面積百分比，并通過 EVOS 分析標尺進行標準像素轉(zhuǎn)換。圖像改編輯自 BioRendera2024。（B）每個培養(yǎng)皿的五張多通道圖像所得到的感染率百分比。圖像采集使用 EVOS M7000 成像系統(tǒng)，在自動采集操作程序下進行。在 EVOS 分析軟件上進行了熒光染色分析，并通過 Celleste6.0 軟件進行了常規(guī)的四步 ICC 方法來源的數(shù)據(jù)分析。

在 EVOS M7000 成像系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific）上對病毒感染進行了顯微鏡觀察，該系統(tǒng)能夠獲取顯示有彩色沉淀（或 FITC）的感染細胞的圖像，這些圖像分別在透射光和綠色熒光蛋白（GFP）通道中獲取。亮度、聚焦和每張圖像的計數(shù)等設置是手動設定的，每張圖像的目標數(shù)量（感染細胞）被設定在 10 到 100 之間，并通過之前的感染時間和 MOI 進行優(yōu)化。經(jīng)過手動校準后，進行了自動圖像采集，以獲得每個孔的 n 張圖像，跨越多個通道。本研究的自動圖像采集包括透射光（用于常規(guī)的彩色沉淀產(chǎn)物）、紅色熒光蛋白（轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物）、綠色熒光蛋白（FITC）和 DAPI（Hoechst），每張孔中有 40 張圖像用于采樣，整個孔有 192 張圖像。圖像以隨機順序獲取，并在所有孔的相同位置隨機選擇以供所有實驗使用。所得的圖像通過圖像拼接技術(shù)將各個部分組合在一起，以生成不同狀況下的整孔圖像。感染率指標是通過將熒光陽性細胞的總計數(shù)（來自顯微鏡觀察，以 RFP 作為轉(zhuǎn)導單位或以 GFP 作為抗六聚體）除以細胞總數(shù)（通過核染色（Hoechst 染色）來表示。

綜合來看，該項研究中將熒光滴度檢測與全自動高通量采集與分析相結(jié)合的方法，相較于傳統(tǒng)的滴度檢測方法具有諸多優(yōu)勢。其中最顯著的優(yōu)勢包括能夠提供更全面和準確的病毒滴度測定，同時還能節(jié)省資源消耗以實現(xiàn)精準病毒定量。該一步法歸功于方法設計中的諸多改進，包括其具有高通量數(shù)據(jù)采集和分析能力，能夠以更快的速度進行更多的數(shù)據(jù)分析，并在培養(yǎng)皿的整個表面獲得更全面、更完整的數(shù)據(jù)信息。這避免了傳統(tǒng)病毒定量方法中存在的顯著的采樣偏差影響，進而獲得更精確的計算和分析結(jié)果。另外也兼容更多的容器類別，而無需其他額外的投入，這也體現(xiàn)了該方案的高通量特性以及它所帶來的經(jīng)濟性和可操作性。