AAV-PCSK9造模方法

利用小鼠構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化的模型，通常用如下方法：包裝PCSK9腺相關(guān)病毒 (rAAV-D377Y-mPCSK9/ rAAV-D374Y-hPCSK9) ， 通過(guò) 靜脈注射 的方法，將 2-5×10E11vg病毒 注射至8周齡左右的小鼠體內(nèi)，然后 高脂飲食喂養(yǎng)12周后 進(jìn)行取材檢測(cè)。

客戶案例：

動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病致死率高，由功能失調(diào)的脂質(zhì)負(fù)載巨噬細(xì)胞（泡沫巨噬細(xì)胞）引發(fā)。目前調(diào)控泡沫巨噬細(xì)胞形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子尚未明確，已知芳香烴受體相互作用蛋白（AIP）可抑制巨噬細(xì)胞膽固醇酯積累，可能抑制動(dòng)脈粥樣硬化泡沫巨噬細(xì)胞的生成，但對(duì)AIP及其他關(guān)鍵基因相關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)分析較少，亟待深入研究以明確泡沫巨噬細(xì)胞形成的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制。

2025年3月23日，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院孫陽(yáng)教授團(tuán)隊(duì)在Advanced Science?(IF14.1)發(fā)表題為“Macrophage HM13/SPP Enhances Foamy Macrophage Formation and Atherogenesis”的論文。研究發(fā)現(xiàn)AIP下調(diào)巨噬細(xì)胞HM13/SPP，HM13/SPP促進(jìn)泡沫巨噬細(xì)胞生成和動(dòng)脈粥樣硬化形成，為治療動(dòng)脈粥樣硬化提供了潛在靶點(diǎn)。

· 維真助力·

病毒產(chǎn)品：AAV8-PCSK9D377Y

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Hm13fl/fl 、Hm13mKO 及Hm13mOE 小鼠

注射方式：尾靜脈單次注射

病毒用量：6×10^11 viral particles

造模方法：注射病毒后，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)下恢復(fù)7天，隨后西方飲食喂養(yǎng)12周

西方飲食喂養(yǎng)的rAAV8-Pcsk9模型小鼠的LDLR表達(dá)情況及血漿脂質(zhì)水平

研究結(jié)果

1. AIP與AHR的相互作用抑制HM13轉(zhuǎn)錄激活，從而抑制巨噬細(xì)胞脂質(zhì)積聚

研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)人類動(dòng)脈粥樣硬化斑塊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行WGCNA分析及候選基因篩選，發(fā)現(xiàn)ERAD蛋白酶基因HM13在STAGE動(dòng)脈粥樣硬化斑塊隊(duì)列中顯著上調(diào)；通過(guò)分析scRNAseq數(shù)據(jù)集，確定AIP和HM13在泡沫巨噬細(xì)胞中均有較高表達(dá)，且呈顯著負(fù)相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)中，oxLDL處理可下調(diào)巨噬細(xì)胞AIP mRNA和蛋白表達(dá)，上調(diào)HM13/SPP mRNA和蛋白表達(dá)。對(duì)人冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和匹配的正常冠狀動(dòng)脈樣本分析發(fā)現(xiàn)，冠狀動(dòng)脈斑塊中 CD45+CD68+巨噬細(xì)胞和泡沫巨噬細(xì)胞百分比顯著高于正常樣本，且AIP與HM13在冠狀動(dòng)脈斑塊泡沫巨噬細(xì)胞中呈顯著負(fù)相關(guān)，在人頸動(dòng)脈斑塊泡沫巨噬細(xì)胞中也得到了蛋白水平的驗(yàn)證。鑒于AIP與HM13/SPP表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，研究人員假設(shè)AIP可能下調(diào)巨噬細(xì)胞中HM13/SPP的表達(dá)，且該過(guò)程可能通過(guò)抑制p38-c-JUN信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。在hMDMs 和mBMDMs中過(guò)表達(dá)WT AIP（AIP-WT）或AIP突變體（AIPΔCT）并暴露于oxLDL 24 小時(shí)。結(jié)果顯示，AIP-WT可抑制p38 和c-JUN的磷酸化，下調(diào)HM13 mRNA和蛋白表達(dá)，減少oxLDL處理細(xì)胞中總膽固醇、膽固醇酯和甘油三酯的積累；而AIPΔCT無(wú)此作用。

AIP與AHR相互作用抑制HM13轉(zhuǎn)錄激活及巨噬細(xì)胞脂質(zhì)積聚

2. 髓系HM13/SPP在兩種高脂血癥動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型中增加斑塊負(fù)荷和泡沫巨噬細(xì)胞負(fù)荷

數(shù)據(jù)表明巨噬細(xì)胞HM13/SPP增強(qiáng)了oxLDL誘導(dǎo)的泡沫巨噬細(xì)胞的形成和促炎特性。研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步利用兩種高脂血癥動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型，探究髓系HM13/SPP對(duì)斑塊負(fù)擔(dān)和泡沫巨噬細(xì)胞負(fù)載的影響。在移植模型中，ApoE?/?Hm13mKO嵌合體小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化程度減輕，主動(dòng)脈竇病變和壞死核心、 泡沫巨噬細(xì)胞負(fù)載和總體Mac3+免疫反應(yīng)面積均較小，而ApoE?/?Hm13mOE嵌合體小鼠則與之相反。

在注射AAV8-Pcsk9誘導(dǎo)的模型中，Hm13mKO rAAV8-Pcsk9小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化程度減輕，主動(dòng)脈竇病變和壞死核心以及泡沫巨噬細(xì)胞尺寸較小，在Hm13mOE rAAV8-Pcsk9小鼠中則表現(xiàn)相反。

HM13/SPP增加動(dòng)脈粥樣硬化負(fù)擔(dān)

3. 巨噬細(xì)胞HM13/SPP通過(guò)HO-1降解促進(jìn)泡沫巨噬細(xì)胞形成和動(dòng)脈粥樣硬化

免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明，HM13/SPP能與HO-1結(jié)合，且其催化活性可降低HO-1蛋白表達(dá)。在THP-1巨噬細(xì)胞中進(jìn)行的脈沖追蹤分析顯示，具有催化活性的HM13/SPP可切割HO-1。通過(guò)環(huán)己酰亞胺（CHX）追蹤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Hm13mOE 可促進(jìn)hemin刺激的mBMDMs中HO-1的降解，Hm13mKo 則抑制該過(guò)程；在hMDMs中，抑制HM13/SPP也可抑制HO-1的降解。用蛋白酶體抑制劑環(huán)氧霉素預(yù)處理可消除Hm13mOE 對(duì)HO-1降解的促進(jìn)作用，而溶酶體途徑抑制劑氯喹則無(wú)此效果，表明 HM13/SPP介導(dǎo)的HO-1切割是其蛋白酶體降解所必需的。進(jìn)一步的分析表明RNF139和DERLIN-1是HM13/SPP介導(dǎo)的HO-1切割和后續(xù)降解所必需的。隨后的研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞HM13/SPP通過(guò)促進(jìn)HO-1降解，下調(diào)膽固醇流出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)，影響脂質(zhì)積累和炎癥因子釋放，進(jìn)而在細(xì)胞、動(dòng)物和人體樣本層面促進(jìn)泡沫巨噬細(xì)胞形成和動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。

巨噬細(xì)胞HM13/SPP通過(guò)降解HO-1促進(jìn)泡沫巨噬細(xì)胞形成和動(dòng)脈粥樣硬化

研究結(jié)論

本研究揭示AIP與AHR的相互作用下調(diào)了巨噬細(xì)胞HM13/SPP，后者是oxLDL誘導(dǎo)的脂質(zhì)積聚、泡沫巨噬細(xì)胞生成和動(dòng)脈粥樣硬化形成的驅(qū)動(dòng)因素。因此，靶向巨噬細(xì)胞AIP-HM13/SPP軸的療法或可對(duì)抗泡沫巨噬細(xì)胞的形成，但對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊消退和穩(wěn)定性的影響需進(jìn)一步研究。