做基因功能、疫苗、溶瘤病毒、細(xì)胞標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，腺病毒是真的好用 —— 表達(dá)強(qiáng)、快、不整合、滴度高。但很多人包裝腺病毒都會(huì)踩坑：不長空斑、不病變、收不到毒、污染、滴度低。這篇整理了腺病毒包裝超詳細(xì)教程：，新手也能一次成功。

一、腺病毒包裝系統(tǒng)

目前常用的腺病毒包裝體系有 AdEasy 和 AdMAX 兩種，其共同特點(diǎn)是目的基因首先克隆到穿梭載體，然后再重組至腺病毒骨架上。這兩個(gè)系統(tǒng)均具有腺病毒早期轉(zhuǎn)錄復(fù)制基因 E1 和 E3 的缺陷 (ΔE1, ΔE3)，其中E3 基因?qū)Σ《井a(chǎn)生并非必需。因此，腺病毒包裝必需依賴表達(dá) E1 的細(xì)胞系，例如 HEK-293 等。 維真生物采用的腺病毒包裝系統(tǒng)包括了 AdEasy 和 AdMax 系統(tǒng)，其中 AdMax 系統(tǒng)操作簡(jiǎn)便、重組效率高、獲得的病毒產(chǎn)率也高，是當(dāng)前腺病毒包裝主要采用的系統(tǒng)。

AdEasy 系統(tǒng)

AdMax 系統(tǒng)

二. 腺病毒包裝流程 （以 AdMax 系統(tǒng)為例）

1. 目的載體制備

構(gòu)建攜帶目的基因或靶點(diǎn)序列的 pADM 穿梭質(zhì)粒。

2. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將上述目的質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒（pHelper） 共 轉(zhuǎn) 染 HEK293細(xì)胞，進(jìn)行 ORF 同源重組和腺病毒包裝。

3. 毒種收獲

轉(zhuǎn)染后約 14 天進(jìn)行出毒判定， 收集有 CPE（細(xì)胞病變）的細(xì)胞進(jìn)行大量擴(kuò)增。

4. 純化濃縮

采用碘克沙醇密度梯度超速離心法對(duì)腺病毒進(jìn)行純化，濃縮后得到高滴度的腺病毒。

5. 滴度檢測(cè)

去除游離 DNA 分子和病毒蛋白外殼后，采用QPCR 等方法對(duì)腺病毒進(jìn)行滴度測(cè)定。

三、腺病毒（AdV）純化

采用碘克沙醇密度梯度超速離心法對(duì)AdV病毒進(jìn)行純化。碘克沙醇是一種造影劑，已接受了臨床檢驗(yàn)。它具有非離子型、對(duì)細(xì)胞無毒和代謝惰性等優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)在在病毒純化方面應(yīng)用廣泛。它利用不同顆粒之間存在的沉降系數(shù)差，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶。

四、腺病毒（AdV）滴度檢測(cè)

AdV病毒采用多種方法來定量，主要包括QPCR法、孔稀釋法和快速腺病毒滴度免疫檢測(cè)法。