抗體-蛋白偶聯(lián)物的制備與質(zhì)量控制

偶聯(lián)效率優(yōu)化：研究對比了磷酸鹽緩沖液（PBS）與三乙醇胺緩沖液（TSMZ）對偶聯(lián)反應(yīng)的影響。通過 Phenomenex BioSep-SEC-S3000 色譜柱分析發(fā)現(xiàn)（圖一），在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）和 TSMZ 緩沖液溶液中，以 1:2 的抗體與鏈霉親和素比例進行偶聯(lián)反應(yīng)，使用 TSMZ 時產(chǎn)率要高得多（40% vs. PBS的8%）。以 2:1 的抗體與鏈霉親和素比例進行偶聯(lián)可以減少多聚體生成。

純化驗證：曲妥珠單抗-鏈霉親和素偶聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)凝膠過濾純化后，與未偶聯(lián)抗體分別進樣 BioSep-SEC-S3000 進行分析。圖二顯示偶聯(lián)物的保留時間比未偶聯(lián)抗體早幾分鐘，峰形對稱且沒有較早洗脫的雜質(zhì)，這表明偶聯(lián)產(chǎn)物的純度很高。使用已知分子量的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品對尺寸排阻色譜柱進行校準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)在 44 -670kDa 范圍內(nèi)，保留時間（RT）與 log₁₀ 分子量的關(guān)系呈線性，其方程為 log (MW_t) = (RT - 37.8)/ -4.32。由于該偶聯(lián)物的洗脫保留時間為 14.6 分鐘，計算得出其分子量為 238kDa，這與一分子曲妥珠單抗（185kDa）和一分子鏈霉親和素（50kDa）的總分子量 235kDa 非常吻合。SEC 的結(jié)果驗證了工藝的穩(wěn)定性。

點擊化學(xué)介導(dǎo)的放射性標(biāo)記：從反應(yīng)優(yōu)化到體內(nèi)代謝

條件篩選：監(jiān)測不同 TCO 投料比（3–15 eq.）對抗體偶聯(lián)物 Zeta 電荷的影響（電位從 +11.6 mV 降至 +5.1 mV），并通過 Phenomenex BioSep-SEC-S3000 色譜柱分析聚集體含量（圖三），找到相對適合的偶聯(lián)條件。在研究偶聯(lián)物摩爾比和用量對點擊化學(xué)介導(dǎo)的放射性標(biāo)記影響時，提高當(dāng)量會增加聚集體形成的風(fēng)險，干擾點擊反應(yīng)的正常進行，進而降低放射化學(xué)產(chǎn)率，所以 SEC 的結(jié)果能夠幫助優(yōu)化最佳標(biāo)記條件（表一）。

定點標(biāo)記抗體的穩(wěn)定性與成像驗證

使用 Phenomenex BioSep-SEC-S3000 分析了純化后的 ⁸⁹Zr-Df- 硫代曲妥珠單抗偶聯(lián)物，平均產(chǎn)物純度超過 93%。同時對偶聯(lián)物體外血清穩(wěn)定性進行檢測，通過 SEC 結(jié)果觀察到有高分子量物質(zhì)緩慢形成，推測這些高分子量物質(zhì)為聚集體。