通過將樣本接種到適宜的培養(yǎng)基，觀察是否形成菌落（Colony Forming Unit, CFU）被視為判斷細菌存活狀態(tài)的金標準，但細菌的不可培養(yǎng)狀態(tài)（Viable But Non-Culturable, VBNC）帶來了挑戰(zhàn)。VBNC是細菌在不利環(huán)境壓力下形成的一種可逆性生存策略，而非真正死亡，它在環(huán)境持留、疾病傳播以及檢測失敗中具有重要意義^[2]。

2024 年發(fā)表在 Nature Communications 上的一項研究，給出了一個非常直觀、也非常“刺眼”的例子：在水環(huán)境中，李斯特菌（Listeria）通過主動丟棄細胞壁進入VBNC狀態(tài)^[3]。在這種狀態(tài)下，細菌對環(huán)境壓力具有更強耐受性，同時也逃逸了幾乎所有常規(guī)的檢測手段。這項研究真正值得警惕的地方在于：這些“看不見”的細菌，在合適條件下仍然可以恢復生長，甚至重新具備致病性。

采用非培養(yǎng)方法，如 LIVE/DEAD BacLight 細菌活力檢測染色能直接通過顯微觀察來檢測細胞是否具有完整的細胞質(zhì)膜，從而判斷其存活狀態(tài)。SYTO BC 染料，是一種核酸染色劑，它可輕易滲透革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，在活細菌內(nèi)產(chǎn)生異常明亮的綠色熒光信號；碘化丙啶核酸染料（PI）只能滲透受損的細胞膜，但憑借更高的親和力，PI可以令已經(jīng)死亡或即將死亡的細菌發(fā)出紅色熒光。

利用特異識別cell-wall-deficient Listeria monocytogenes 的抗體與LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability kit (貨號L7012) ，跟蹤細胞壁狀態(tài)同時監(jiān)控細菌存活情況，證明李斯特菌在向VBNC狀態(tài)轉變的過程中逐漸喪失其細胞壁。

雖然BacLight 是優(yōu)秀的生理檢測手段，但SYTO/PI LIVE–DEAD BacLight報告的是核酸可及性與膜通透性，而非細菌代謝狀態(tài)或長期命運。這一點在單細胞層面的成像研究中被進一步放大。

英國利物浦大學表面科學與抗菌材料團隊發(fā)現(xiàn)，運用熒光顯微鏡和SYTO9/PI LIVE–DEAD 染色雖然能夠?qū)毦后w存活情況做出概覽，但SYTO9/PI 染色與細胞膜完整性并非一一對應，它無法真實反映單細胞生理狀態(tài)^[4]。即使呈現(xiàn)相同的 SYTO9/PI 染色結果，細胞在膜結構、完整性以及內(nèi)部組織狀態(tài)上仍可能存在顯著差異。必須尋找能夠進一步細化分析細菌活性的高靈敏檢測方法才能滿足抗菌材料開發(fā)工作需求。

染色狀態(tài)識別示意圖。SYTO 9/PI共染可能獲得四種不同狀態(tài)的細菌染色結果，因此紅/綠二元判斷不足以在單細胞水平回答細菌是死還是活這一問題。

流式細胞分選技術原理示意圖

1. 快速建立細胞群體輪廓

2. 結合流式多參數(shù)信息識別連續(xù)譜

3. 聚焦那些原本會被一刀切掉的中間態(tài)群體

流式細胞術的獨特價值在于它不急著給細菌下結論。

流式并不要求你先回答“它是活還是死”，而是允許你先看到一個事實：在同一處理條件下，細菌群體本身就是高度異質(zhì)的。

1. 處在 PI 高、PI 低、或連續(xù)過渡區(qū)間的不同亞群

2. FSC/SSC 明顯改變、但并未完全崩解的細胞

3. 染色信號與結構狀態(tài)不再一一對應的“灰區(qū)群體”

4. Flow cytometry in microbiology

這些細胞，正是最容易被培養(yǎng)法和傳統(tǒng)染色法忽略，卻最可能恢復活性的部分。

更重要的是，流式細胞術提供的并不是一張“好看”的結果圖，而是一個可量化、可比較、可重復的單細胞分布圖。這讓研究者第一次有機會，把 VBNC 從一個“模糊概念”，轉變?yōu)榭梢员幌到y(tǒng)研究的生理狀態(tài)譜系。

當研究重心從“有沒有長出來”轉向

“在這一刻，群體中每一個細菌處在什么狀態(tài)”

細菌存活性研究，才真正進入了一個新的階段。