內(nèi)毒素是細胞培養(yǎng)過程中不容忽視的問題。細胞培養(yǎng)試劑或介質(zhì)內(nèi)毒素過高，會干擾細胞的正常生長和分化，甚至導(dǎo)致實驗失敗。內(nèi)毒素通過誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)抑制細胞生長或誘導(dǎo)其凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，低濃度內(nèi)毒素（< 1ng/mL，1ng≈10EU）可刺激細胞產(chǎn)生細胞因子、激活小鼠巨噬細胞。

內(nèi)毒素是如何偷偷毀掉你的細胞實驗?zāi)兀考毎涿畹乃劳觯扛杉毎D(zhuǎn)染效率低至30%？同樣的protocol卻無法重復(fù)出結(jié)果？這可能是內(nèi)毒素在“搗亂”。內(nèi)毒素隱藏在細胞培養(yǎng)基、添加物、質(zhì)粒中，難以被發(fā)現(xiàn)，卻悄無聲息的吞噬著實驗數(shù)據(jù)和結(jié)果。

一、什么是內(nèi)毒素？

內(nèi)毒素是革蘭陰性菌外膜中獨特的結(jié)構(gòu)成分，主要為脂多糖（LPS）。內(nèi)毒素穩(wěn)定性強，耐高溫、耐酸堿。內(nèi)毒素難以被發(fā)現(xiàn)，且不易去除。微量內(nèi)毒素（1-5 ng/kg）可引起體溫上升，發(fā)熱反應(yīng)持續(xù)約4小時。在生物制藥、干細胞研究中，內(nèi)毒素因干擾細胞信號和代謝而對細胞產(chǎn)生毒性。特別是無血清培養(yǎng)基，缺乏血清中的天然抗菌成分，更易被內(nèi)毒素污染。

二、內(nèi)毒素對細胞培養(yǎng)的影響

多種細胞易受內(nèi)毒素影響，如巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞、淋巴細胞、肝細胞、血小板、內(nèi)皮細胞等。極低濃度的內(nèi)毒素就能干擾細胞正常的生理功能。Schwarz H等人發(fā)現(xiàn)0.02-2 ng/mL的脂多糖能激活細胞的免疫反應(yīng)，且不同細胞對內(nèi)毒素的敏感度不一樣。如THP-1細胞在受到最高濃度LPS（2 ng/mL）刺激時，僅IL-8表達量顯著增加，而在相同濃度下，moDCs會大量分泌IL-6、IL-8、IL-12和TNF-α。人單核細胞和CD1c⁺ DCs對內(nèi)毒素更敏感，0.2 ng/mL的LPS能夠誘導(dǎo)所有細胞因子釋放。

低濃度LPS對不同人類免疫細胞細胞因子產(chǎn)生的影響（源自文獻：DOI:10.1371/journal.pone.0113840）

內(nèi)毒素與細胞膜上的受體結(jié)合，激活免疫反應(yīng)，釋放TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等炎性細胞因子，影響細胞生理功能和信號通路紊亂，進而影響細胞生長和代謝，甚至造成細胞凋亡。內(nèi)毒素提前激活免疫細胞會干擾對細胞因子正常免疫調(diào)節(jié)功能的研究，出現(xiàn)實驗結(jié)果偏差。

內(nèi)毒素過高會造成細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，如體積縮小、折光率降低等。內(nèi)毒素還抑制細胞的增殖，如G0/G1期延長、S期縮短等會導(dǎo)致細胞生長停滯或凋亡。內(nèi)毒素在敏感細胞中誘導(dǎo)caspase-3介導(dǎo)的凋亡通路，使原代細胞存活率驟降。內(nèi)毒素通過磷酸基團與細胞膜上的蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，或脂肪酸鏈與細胞膜上的脂質(zhì)膜和蛋白質(zhì)親水區(qū)發(fā)生作用，改變細胞膜形態(tài)，導(dǎo)致細胞功能障礙。

研究人員通過MTT法測定了脂多糖（LPS）對H292和THP-1細胞的毒性作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未處理的對照組相比，低濃度（1-2.5 μg/mL） LPS處理后，細胞活力未觀察到顯著變化，表明此濃度下的LPS對細胞無毒性。而高濃度（5-20 μg/mL）的LPS對H292和THP-1細胞具有顯著的細胞毒性。

LPS刺激對H292與THP-1細胞活力的影響（源自文獻：DOI: 10.3892/mmr.2018.8542）

內(nèi)毒素對細胞功能有顯著影響，如影響細胞的基因表達、能量代謝和蛋白質(zhì)合成。內(nèi)毒素還會與轉(zhuǎn)染試劑、質(zhì)粒DNA降低細胞轉(zhuǎn)染效率。

因此，在細胞培養(yǎng)實驗中，內(nèi)毒素影響細胞的生理狀態(tài)和功能，降低實驗的可靠性和可重復(fù)性，此外，內(nèi)毒素的存在可能影響細胞因子和蛋白質(zhì)的表達控制，細胞信號通路、蛋白質(zhì)相互作用等研究需要注意內(nèi)毒素的干擾。對于細胞衍生產(chǎn)品（如疫苗、免疫細胞治療等）更應(yīng)關(guān)注內(nèi)毒素污染。

三，細胞培養(yǎng)過程中如何避免內(nèi)毒素污染

革蘭氏陰性菌是細胞培養(yǎng)環(huán)境中的常見污染源，細菌死亡裂解或?qū)е聝?nèi)毒素釋放。培養(yǎng)基中的血清或蛋白質(zhì)成分含有較高內(nèi)毒素也會影響細胞生長。在細胞的傳代、凍存等環(huán)節(jié)操作不當也會導(dǎo)致內(nèi)毒素污染。細胞培養(yǎng)所有容器和包裝材料也會因制造工藝而含有內(nèi)毒素。

針對內(nèi)毒素污染的來源，可以通過以下措施控制內(nèi)毒素：

原料控制：選擇低內(nèi)毒素或超低內(nèi)毒素的試劑和介質(zhì)，從源頭控制內(nèi)毒素。

細胞株選擇：某些腫瘤細胞株對內(nèi)毒素敏感度較低可優(yōu)先選擇。

培養(yǎng)環(huán)境選擇：定期殺菌和在位清洗，減少大腸桿菌污染。優(yōu)化細胞培養(yǎng)條件，如溫度、pH值、滲透壓等，以降低內(nèi)毒素對細胞的不良影響。

質(zhì)量控制：對所用試劑進行內(nèi)毒素檢測，保證內(nèi)毒素含量符合標準。

人員培訓(xùn)：確保操作合規(guī)，避免人員操作問題引入細菌內(nèi)毒素。

四、重組蛋白內(nèi)毒素對細胞培養(yǎng)的影響

重組細胞因子在細胞培養(yǎng)和擴增分化過程中具有重要作用。免疫學(xué)實驗、細胞凋亡實驗、干細胞培養(yǎng)與分化、類器官模型構(gòu)建等，都需要使用低水平內(nèi)毒素的細胞因子。細胞因子功能分析、蛋白互作研究，使用更低水平內(nèi)毒素的重組蛋白是獲取可靠實驗結(jié)果的基礎(chǔ)。

為評估重組蛋白中內(nèi)毒素對細胞的免疫反應(yīng)，Schwarz H等人構(gòu)建了對LPS高度敏感的HEK293細胞，將這些細胞分別暴露于不同濃度的重組蛋白（來自兩個不同的供應(yīng)商）和LPS中。結(jié)果顯示，供應(yīng)商1的重組蛋白可使NF-kB表達量升高，而供應(yīng)商2的重組蛋白則未激活NF-kB表達。供應(yīng)商1重組蛋白誘導(dǎo)NF-kB表達的效果與0.02 ng/mL LPS相近，說明重組蛋白中少量內(nèi)毒素污染（1.4 EU，0.014 ng/100 ng蛋白）足以激活NF-κB通路。

內(nèi)毒素對HEK293細胞中NF-kB激活的影響（源自文獻：DOI:10.1371/journal.pone.0113840）

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參考文獻：

Schwarz H, et al. Residual Endotoxin Contaminations in Recombinant Proteins Are Sufficient to Activate Human CD1c+ Dendritic Cells. PLoS ONE. 2014. doi:10.1371/journal.pone.0113840

Xuefang Liu, et al. LPS?induced proinflammatory cytokine expression in human airway epithelial cells and macrophages via NF-κB, STAT3 or AP-1 activation. Mol Med Rep. 2018. doi: 10.3892/mmr.2018.8542