RNA在生物調(diào)控中其中非常重要的作用，它通過(guò)影響基因的表達(dá)或者修飾來(lái)調(diào)控細(xì)胞或機(jī)體的功能，進(jìn)而驅(qū)動(dòng)多樣化的生物學(xué)進(jìn)程。而RNA中，研究最多的當(dāng)屬mRNA了。常見(jiàn)的樣本的基因表達(dá)研究亦或者是mRNA疫苗等等都是與mRNA關(guān)聯(lián)。我們都知道，mRNA的兩大特征大于5端“帽子結(jié)構(gòu)”以及3端的poly（A）尾，那大家知道poly（A）尾對(duì)它的重要性么？
保護(hù)mRNA不被降解。
增加mRNA的穩(wěn)定性。
提高mRNA的翻譯效率。
哺乳動(dòng)物的poly A尾平均長(zhǎng)度約為200nt，其在酵母中平均約70nt；
Poly A尾長(zhǎng)度并非恒定不變，poly A尾中也可以含有非A的核苷酸組分來(lái)抑制mRNA的衰變降解途徑；
Poly A尾長(zhǎng)度、翻譯效率和mRNA穩(wěn)定性之間并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。例如非洲爪蟾卵母細(xì)胞：32nt以上的poly A尾在翻譯效率上就等同于150nt長(zhǎng)度的poly A尾，但當(dāng)poly A尾長(zhǎng)度不足16nt時(shí)，mRNA無(wú)法翻譯。
Poly（A）尾的有無(wú)以及其長(zhǎng)度是mRNA藥物的關(guān)鍵質(zhì)量控制參數(shù)之一。根據(jù)mRNA種類的差異，通常poly（A）尾的長(zhǎng)度在幾十至幾百個(gè)核苷酸（nt）之間。
基于電泳的poly（A）尾檢測(cè)技術(shù)：與加帽率的分析策略類似，RNase T1酶切后純化回收3’端polyA尾，隨后通過(guò)毛細(xì)管電泳（CE）、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、高效液相色譜（HPLC）或液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS），對(duì)polyA尾進(jìn)行定性和定量分析。
基于RT-PCR的poly（A）尾檢測(cè)技術(shù)：其代表為RACE-PAT（rapid amplification of cDNA ends poly(A) test）、LM-PAT（ligase-mediated poly(A) test）、ePAT（extension poly(A) test）、sPAT(splint-mediated poly(A) test)、Hire-PAT(high-resolution poly(A) test)等。
基于二代測(cè)序技術(shù)表征polyA：已報(bào)道的測(cè)序方法包括TAIL-seq、PAL-seq及其衍生技術(shù)mTAIL-seq 、PAL-seq v2、PAL-seq v3、PAL-seq v4等。
基于三代測(cè)序技術(shù)表征polyA：FLEP-seq(full-length elongating and polyadenylated RNA sequencing)、FLEP-seq2、FLAM-seq(full-length mRNA sequencing)、PAIso-seq(poly(A) inclusive RNA isoform sequencing) 、PAIso-seq2 、SM-PAT-seq、Nano3P-seq、DRS等。
圖：poly（A）尾檢測(cè)技術(shù)發(fā)展示意圖[1]
圖：poly（A）尾檢測(cè)技術(shù)流程示意圖[1]
表2 基于三代單分子測(cè)序的poly(A)尾檢測(cè)技術(shù)[1]
檢測(cè)方法 | RNA最低起始量 | Poly(A)尾捕獲方法 | Poly(A)尾序列檢測(cè)情況 | 測(cè)序平臺(tái) |
FLAM-seq | 500 ng | G/I延伸 | 可檢測(cè)內(nèi)部非A殘基 | PacBio HiFi |
FLEP-seq | 3 μg | 3'端接頭直接連接 | 可檢測(cè)內(nèi)部和末端非A殘基 | ONT或PacBio HiFi |
FLEP-seq2 | 500 ng | 3'端接頭直接連接 | 可檢測(cè)內(nèi)部和末端非A殘基 | ONT或PacBio HiFi |
PAIso-seq | 0.5 ng | 末端延伸 | 可檢測(cè)內(nèi)部非A殘基 | PacBio HiFi |
PAIso-seq2 | 100 ng | 3'端接頭連接 | 可檢測(cè)內(nèi)部和末端非A殘基 | PacBio HiFi |
PAPA-seq | 100 ng | G/I延伸 | 可檢測(cè)內(nèi)部非A殘基 | PacBio HiFi |
SM-PAT-seq | 4 μg | 3'端夾板接頭連接 | 可檢測(cè)內(nèi)部非A殘基 | PacBio HiFi |
Nano3P-seq | 500 ng | 模板置換 | 可檢測(cè)內(nèi)部和末端非A殘基 | ONT |
Direct RNA sequencing | 100 ng | 3'端夾板接頭連接 | 算法依賴 | ONT |
翌圣生物基于FLEP-seq流程，在序風(fēng)Cyclone平臺(tái)測(cè)試T7體外轉(zhuǎn)錄的Luciferase mRNA。500 ng和800 ng投入的Luciferase mRNA的檢測(cè)結(jié)果一致，重復(fù)性也較好。
應(yīng)用方向 | 產(chǎn)品 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) |
三代測(cè)序 | RNA逆轉(zhuǎn)錄 | Hieff? LongSeq cDNA Library Prep Kit for CycloneSEQ | 12937ES |
三代建庫(kù) | Hieff? DNA Library Prep Kit for ONT | 13301ES | |
Barcode | ONT專用Barcode | 13317~13320ES | |
純化磁珠 | Hieff NGS? DNA Selection Beads V2 DNA 分選磁珠 V2 | 12418ES | |
文庫(kù)定量 | 1× dsDNA HS Assay Kit 即用型dsDNA qubit定量試劑 | 12642ES | |
PolyA酶切 | RNase T1 酶 | RNase T1 (500 U/μL) | 14691ES |
Thermostable RNase T1 (500 U/μL) | 14692ES | ||
體外轉(zhuǎn)錄 | T7 RNA 合成Kit | T7 High Yield RNA Synthesis Kit | 10623ES |
T7 High Yield RNA Synthesis Kit for Co-transcription | 10673ES | ||
T7 RNA Polymerase | T7 RNA Polymerase GMP-grade (50 U/μL) | 10624ES | |
T7 RNA Polymerase GMP-grade（250 U/μL) | 10625ES | ||
T7 RNA Polymerase （50 U/μL） | 10618ES | ||
T7 RNA Polymerase （250 U/μL） | 10626ES | ||
10×Transcription Buffer | 10× Transcription Buffer 2 GMP-grade | 10670ES |
參考文獻(xiàn)：
[1] 賈錚,劉靜雯,陸發(fā)隆.Poly(A)尾檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國(guó)科學(xué)（生命科學(xué)）, 2025(6).
翌圣生物
翌圣生物科技（上海）股份有限公司成立于2014年，是一家聚焦生命科學(xué)產(chǎn)業(yè)鏈上游核心原料，從事核苷酸、蛋白、細(xì)胞和類器官四大品類生物試劑的研發(fā)、生產(chǎn)與銷售的高新技術(shù)企業(yè)。公司兼?zhèn)浜诵募夹g(shù)自主研發(fā)和規(guī)模化生產(chǎn)能力，核心產(chǎn)品數(shù)量達(dá)數(shù)千種，覆蓋分子克隆、qPCR、NGS、體外轉(zhuǎn)錄、抗體、蛋白純化及分析、細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、報(bào)告基因檢測(cè)和類器官等多種系列，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究、診斷檢測(cè)和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域。
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