全長轉(zhuǎn)錄本測序基于單分子實時測序Pacbio Sequel平臺，它以長讀長的優(yōu)勢、結(jié)合多片段文庫篩選技術(shù)，實現(xiàn)了無需拼接的轉(zhuǎn)錄本分析，克服了傳統(tǒng)二代轉(zhuǎn)錄組轉(zhuǎn)錄本拼接短、信息不完整的缺陷，可大大提高可變剪接、基因融合等分析的準(zhǔn)確性。

當(dāng)然全長轉(zhuǎn)錄組測序除了不能定量以外的另一缺點就是價格昂貴，因為轉(zhuǎn)錄組信息存在組織差異，單一組織得到的全長轉(zhuǎn)錄本對該物種其他部位組織可能不是很全面或不太適用，所有部位單獨建庫測序的成本也很高，所以用一個物種不同部位組織混樣進行高深度測序，會得到相對比較全面的參考轉(zhuǎn)錄本庫信息，也是降低測序成本的理想方法之一。

因為Pacbio 測序的原理：直徑只有幾十納米的零模波導(dǎo)孔，單分子的DNA聚合酶被固定在這個孔內(nèi)，將構(gòu)建好的全長轉(zhuǎn)錄組文庫需要loading進去后進行測序。但是loading因為其對短片段的偏好性，會導(dǎo)致短片段占據(jù)過多數(shù)據(jù)量，而大部分長片段沒有測到，因此一般會推薦構(gòu)建片段分級文庫。為了降低loading偏差的影響，構(gòu)建分級文庫越多，也會得到更全面的全長轉(zhuǎn)錄本。全長轉(zhuǎn)錄組測序一般推薦至少構(gòu)建三種文庫類型，1-2Kb、2-3Kb和3-6Kb文庫,但隨著Sequel和Sequel II數(shù)據(jù)產(chǎn)出爆炸性的增長，一般選擇構(gòu)建混合文庫即1-2Kb,2-4Kb,4-10Kb，將三部分片段進行等量混合構(gòu)建一個混庫測序，可選擇加Barcode混其他樣品共同測序或者單樣本測序，一般推薦多片段混庫數(shù)據(jù)量在10-15G左右，當(dāng)然測序數(shù)據(jù)量越多，檢測到的全長轉(zhuǎn)錄本也會越全面。

影響測序產(chǎn)出的因素有很多，包括樣品初始質(zhì)量、RNA質(zhì)量、文庫的質(zhì)量、文庫的上機定量、測序儀的狀態(tài)等，因此前期的質(zhì)檢步驟是不可或缺的，從RNA提取后的質(zhì)量測定，到分片段濃度和片段大小的測定和ZH出庫是文庫的濃度和大小的測定，都是保證測序產(chǎn)出質(zhì)量的前提。

因為文庫質(zhì)控高通量測序的關(guān)鍵步驟，它關(guān)系到測序的數(shù)據(jù)產(chǎn)量，會直接影響成本，在這里給大家推薦一款三代RNA提取、建庫質(zhì)控神器—Qsep100全自動核酸蛋白分析系統(tǒng)。

三代建庫對提取的total RNA的完整性要求相對較高，以Qsep檢測為例，一般要求RQN＞8，濃度＞300ng/ul，總量＞3ug，基線波動較小。

三代RNA建庫過程中，需要質(zhì)控的是各部分片段的大小和濃度，以便后續(xù)的各片段樣品等量混合建庫，以保證覆蓋的均一性。另外需要質(zhì)控步驟是文庫的大小和濃度，為后續(xù)上機的loading的量提供數(shù)據(jù)，保證loading率以保證后續(xù)的數(shù)據(jù)產(chǎn)出。使用Qsep系列檢測可以同時測定濃度和片段大小，一步到位。

Qsep系列應(yīng)用于全長轉(zhuǎn)錄組測序的提取建庫的質(zhì)控優(yōu)勢在于哪兒呢？首先操作步驟簡單，只需簡單的三步即可完成（如圖）。另外具有更高的通量，并且省去了很多的手動操作時間。除此之外，它們的靈敏度更高（對于檢測的限制更少），并且能完全自動化的獲取數(shù)據(jù)和輸出電子化的數(shù)據(jù)資料。并且能同時檢測片段的大小和濃度。

此外，Qsep系列相較于其他質(zhì)控儀器，其做到了可以單個樣本檢測不浪費試劑，單位成本更低。實現(xiàn)單個樣品檢測，極大地提高了質(zhì)控的靈活性，省去了湊樣的煩惱。另外對于操作人員而言，該儀器ZD的特點為“容錯率”高，何為容錯率呢？即zui大程度降低在實驗過程中有些無法避免的因為操作失誤或者樣本原因引起的需要多次檢測的這種隨機性錯誤造成的成本增加。因為Qsep可以做到單樣本檢測，特殊原因造成的重復(fù)檢測，可以當(dāng)時立刻進行，不需再進行湊樣，從而耽誤整個實驗周期。Qsep系列可謂是wan美助力三代全長轉(zhuǎn)錄組文庫質(zhì)控。