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前言

近年來(lái)，溶酶體早已不再只是“細(xì)胞垃圾處理站”。作為維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、參與自噬和膜運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵細(xì)胞器，溶酶體在多種神經(jīng)退行性疾病中扮演著核心角色。隨著研究的深入，溶酶體離子通道逐漸成為藥物研發(fā)和機(jī)制研究的熱點(diǎn)。然而，由于溶酶體體積小、易破裂、難以形成穩(wěn)定封接，手工操作依賴經(jīng)驗(yàn)，通量低、重復(fù)性差，其電生理研究長(zhǎng)期面臨技術(shù)門檻高、重復(fù)性差的問(wèn)題。

本文基于Sophion Bioscience與Oria Bioscience的最新應(yīng)用報(bào)告，系統(tǒng)介紹了一種基于自動(dòng)化膜片鉗（Automated Patch Clamp, APC）的溶酶體電生理解決方案，并以經(jīng)典溶酶體鈣通道TRPML1為例，展示其在中高通量藥理研究中的可行性與可靠性。

結(jié)果與討論

在本研究中，首先對(duì)放大溶酶體在自動(dòng)膜片鉗平臺(tái)上的捕獲與封接性能進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)估。采用Oria Bioscience提供的LYSO-Prep?溶酶體樣本，并通過(guò)1μM Vacuolin處理將溶酶體平均直徑擴(kuò)大至約3.16μm，從而滿足膜片鉗記錄的尺寸要求（圖1）。在此基礎(chǔ)上，使用小孔徑、高電阻（HiR）芯片進(jìn)行溶酶體捕獲實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，無(wú)論是在QPatch 48還是Qube 384平臺(tái)上，均可穩(wěn)定捕獲單個(gè)溶酶體并形成高阻封接，捕獲成功率分別達(dá)到69.9±3.2%和74.6±2.6%（圖2）。這一結(jié)果表明，經(jīng)優(yōu)化后的自動(dòng)化流程能夠在不同通量平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)高度一致且可靠的溶酶體捕獲性能。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，高電阻芯片在減少“溶酶體滑孔”現(xiàn)象方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。在傳統(tǒng)孔徑較大的芯片中，溶酶體在負(fù)壓作用下容易直接穿過(guò)孔道，表現(xiàn)為封接過(guò)程中短暫而不穩(wěn)定的電阻峰值；而在HiR芯片條件下，這種滑孔現(xiàn)象明顯減少，溶酶體更容易在孔口形成快速且持續(xù)的電阻升高，從而確認(rèn)成功捕獲（圖3）。與此同時(shí)，更高的整體封接電阻也顯著提高了系統(tǒng)對(duì)微小電流信號(hào)的分辨能力，使得低于100pA的溶酶體離子通道電流能夠被清晰記錄。

在成功建立穩(wěn)定溶酶體記錄的基礎(chǔ)上，研究進(jìn)一步驗(yàn)證了 TRPML1 離子通道的功能性及其藥理學(xué)響應(yīng)。在TRPML1過(guò)表達(dá)溶酶體中，加入特異性激動(dòng)劑ML-SA5（10μM）后，在QPatch和Qube平臺(tái)上均可觀察到明顯增強(qiáng)的內(nèi)向和外向電流（圖4A、4B）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在所有成功捕獲的溶酶體中，約有41.3±1.9%（QPatch）和50.3±5.0%（Qube）對(duì)ML-SA5呈現(xiàn)敏感反應(yīng)，說(shuō)明自動(dòng)化膜片鉗系統(tǒng)能夠可靠地區(qū)分功能性表達(dá)TRPML1的溶酶體群體。

為進(jìn)一步確認(rèn)記錄到的電流確實(shí)來(lái)源于TRPML1通道，研究者引入了TRPML1敲除（KO）溶酶體作為陰性對(duì)照。在完全相同的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)TRPML1-KO溶酶體施加10μM ML-SA5并未引起內(nèi)向或外向電流的增強(qiáng)（圖4C），表明ML-SA5的作用具有高度通道特異性，同時(shí)也證明在過(guò)表達(dá)溶酶體中記錄到的電流信號(hào)確實(shí)代表TRPML1介導(dǎo)的離子流動(dòng)。

在藥理定量分析方面，研究通過(guò)在單個(gè)溶酶體上逐步增加ML-SA5濃度（37nM–1μM），構(gòu)建了完整的濃度–反應(yīng)關(guān)系曲線（圖5）?；?90mV條件下測(cè)得的外向電流，QPatch平臺(tái)得到的EC50為0.25μM，Hill系數(shù)為3.87；Qube平臺(tái)對(duì)應(yīng)的EC50為0.19μM，Hill系數(shù)為 2.22。兩種平臺(tái)獲得的藥效學(xué)參數(shù)不僅彼此一致，也與既往文獻(xiàn)中采用全內(nèi)溶酶體膜片鉗技術(shù)得到的數(shù)據(jù)高度吻合，進(jìn)一步驗(yàn)證了該自動(dòng)化體系在藥理學(xué)評(píng)估中的準(zhǔn)確性與可重復(fù)性。

此外，研究還評(píng)估了在接近生理溫度條件下進(jìn)行溶酶體電生理記錄的可行性。在35 °C條件下，Qube平臺(tái)的溶酶體捕獲成功率仍保持在71.1%，與室溫實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，同時(shí)TRPML1對(duì)ML-SA5的激活效應(yīng)依然清晰可辨（圖6）。這一結(jié)果表明，該自動(dòng)化膜片鉗方案不僅適用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，也能夠支持在更接近生理狀態(tài)下開(kāi)展高通量溶酶體離子通道藥理研究。

總結(jié)

本研究表明，Sophion自動(dòng)膜片鉗系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定、可重復(fù)的溶酶體電生理記錄，結(jié)合LYSO?Prep?技術(shù)，讓溶酶體電生理研究變得穩(wěn)定、高通量、可重復(fù)。TRPML1藥理數(shù)據(jù)可靠，支持劑量?反應(yīng)分析，并可拓展至疾病機(jī)制解析和新藥篩選，為溶酶體離子通道研究開(kāi)辟了全新的可復(fù)制路徑。