重要意義

? 溶酶體對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，其功能障礙與多種疾病相關(guān)。鑒于直接的醫(yī)學(xué)相關(guān)性，當(dāng)前亟需對(duì)溶酶體進(jìn)行高通量電生理研究。

? Oria生物科學(xué)公司開(kāi)創(chuàng)了一種新型溶酶體分離技術(shù)，可批量制備高純度、"即用型"的LYSO-Preps制劑。

? 我們已通過(guò)SyncroPatch 384、SURFE2R N1和SURFE2R 96SE系統(tǒng)，成功對(duì)過(guò)表達(dá)TRPML1通道的LYSO-Preps進(jìn)行了特征化研究，包括激活劑/抑制劑的藥理學(xué)分析及腔內(nèi)pH敏感性測(cè)試。

引言  

功能表征溶酶體離子通道的金標(biāo)準(zhǔn)仍是對(duì)從單個(gè)細(xì)胞分離的膨脹溶酶體進(jìn)行手動(dòng)膜片鉗記錄[1]。該技術(shù)耗時(shí)且具有挑戰(zhàn)性，但其他電生理技術(shù)正開(kāi)始克服這些難題，實(shí)現(xiàn)了對(duì)分離溶酶體的更高通量表征。其中一項(xiàng)技術(shù)是自動(dòng)化膜片鉗（APC），它使用平面玻璃基底進(jìn)行全溶酶體膜片鉗記錄。使用APC時(shí)仍需從細(xì)胞中分離溶酶體，這一過(guò)程可能耗時(shí)較長(zhǎng)，且需要精確計(jì)時(shí)才能與APC有效配合。另一項(xiàng)評(píng)估溶酶體離子通道的技術(shù)是基于固體支撐膜的電生理學(xué)（SSME）。這一新興方法已成功用于記錄通過(guò)連續(xù)離心步驟分離的天然溶酶體。

近期，Santinho等人5報(bào)告了一種新型細(xì)胞器分離方法。該技術(shù)通過(guò)高通量流體硬件分離工藝，可獲得高純度的大型單個(gè)細(xì)胞器群體。這一突破性發(fā)明促成了Oria Bioscience公司的創(chuàng)立，該公司為科學(xué)界提供溶酶體、內(nèi)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體等高純度細(xì)胞器制劑。

Oria Bioscience與Nanion Technologies現(xiàn)已開(kāi)發(fā)出檢測(cè)方法，用于表征過(guò)表達(dá)黏脂素TRP通道1(TRPML1)的分離溶酶體——該通道是溶酶體中主要的Ca2+通道[6,7]。TRPML1基因功能障礙與多種疾病相關(guān)，包括IV型黏脂質(zhì)貯積病(MLIV)或尼曼-匹克病，這凸顯了TRPML1及其他溶酶體膜蛋白的醫(yī)學(xué)重要性——這些蛋白可能成為新醫(yī)療策略的潛在治療靶點(diǎn)。

因此，利用高通量電生理技術(shù)在原生環(huán)境中研究細(xì)胞內(nèi)離子通道及其藥理學(xué)特性引起了廣泛關(guān)注。為此，自動(dòng)膜片鉗(APC)和固體支撐膜電生理(SSME)技術(shù)正越來(lái)越多地用于記錄完整溶酶體膜中的離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。本報(bào)告中，我們使用SyncroPatch 384、SURFE2R N1及SURFE2R 96SE儀器，對(duì)Oria Bioscience提供的LYSO-Preps樣本進(jìn)行了功能性表征。

實(shí)驗(yàn)設(shè)置

由Oria Bioscience提供的HEK細(xì)胞源LYSO-Preps（即用型擴(kuò)大溶酶體）包含內(nèi)源性通道或過(guò)表達(dá)的TRPML1通道。使用SyncroPatch 384系統(tǒng)進(jìn)行記錄時(shí)，NPC-384T nanoS型耗材（1x；產(chǎn)品編號(hào)：22 2111）對(duì)實(shí)驗(yàn)成功至關(guān)重要，該耗材專為在記錄過(guò)程中支持和維持溶酶體完整性而設(shè)計(jì)。過(guò)表達(dá)溶酶體標(biāo)記物TMEM192的LYSO-preps如圖1A所示。典型LYSO-Prep中的溶酶體直徑分布如圖1B所示，范圍在數(shù)微米之間，表明用于APC記錄的大部分溶酶體直徑超過(guò)2微米。

得益于高效分離流程，Oria Bioscience提供的SyncroPatch 384記錄樣本通常含有2x10?個(gè)溶酶體，稀釋至每毫升20萬(wàn)個(gè)溶酶體的密度，足以完成多個(gè)SyncroPatch 384芯片（>5個(gè)）的實(shí)驗(yàn)。使用SURFE2R儀器的研究則無(wú)需在傳感器（直徑3毫米；N1產(chǎn)品編號(hào)：161001，96SE產(chǎn)品編號(hào)：181001）上應(yīng)用前通過(guò)vacuolin（或其他試劑）進(jìn)行預(yù)擴(kuò)大處理。

天然LYSO-Preps（未擴(kuò)大溶酶體）經(jīng)Bradford法測(cè)定總蛋白濃度約為2 mg/ml（數(shù)據(jù)未顯示），保存于-80°C直至使用。如圖1C所示，Western blot分析證實(shí)Oria LYSO-Preps具有高純度和高密度，未出現(xiàn)基于離心分離方法常見(jiàn)的其他細(xì)胞器或質(zhì)膜污染問(wèn)題10。

對(duì)于SyncroPatch 384記錄，我們還采用了低細(xì)胞（溶酶體）密度測(cè)量方法，溶酶體數(shù)量減少且體積縮小，同時(shí)保持較高的捕獲率。該方法使我們能夠在"全溶酶體"模式下實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的溶酶體封接，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中封接電阻始終超過(guò)0.2吉?dú)W。這種穩(wěn)定性對(duì)于生成累積劑量反應(yīng)曲線和實(shí)現(xiàn)腔內(nèi)溶液交換至關(guān)重要（圖1D、2和3）。這與SURFE2R儀器不同，后者的記錄基于傳感器表面匯總信號(hào)（電流），其信噪比取決于樣品消耗量與所需信號(hào)幅度之間的平衡。

圖1 A 展示從過(guò)表達(dá)hTMEM192-EGFP的HEK293細(xì)胞中分離的溶酶體圖像，這些溶酶體經(jīng)vacuolin擴(kuò)大后包含在標(biāo)準(zhǔn)LYSO-Prep試劑盒中。采用明場(chǎng)/熒光顯微鏡（X63油鏡）拍攝。B 展示經(jīng)1μM vacuolin擴(kuò)大后瞬時(shí)過(guò)表達(dá)hTMEM192-EGFP的分離溶酶體尺寸分布示例。僅使用FIJI軟件分析可封接溶酶體（>1μm）。C 呈現(xiàn)純化前（細(xì)胞提取物）與純化后（LYSO-Prep及剩余提取物）不同細(xì)胞區(qū)室標(biāo)記蛋白的典型免疫印跡。D 展示全溶酶體記錄的SyncroPatch 384實(shí)驗(yàn)示例，采用從-100至100mV的斜坡協(xié)議（保持電位0mV），并標(biāo)注ML-SA1與NMDG溶液的施加情況。插圖：簡(jiǎn)化示意圖顯示溶酶體被吸引至膜片鉗孔徑的過(guò)程。

結(jié)果：

APC圖1D展示了達(dá)到全溶酶體構(gòu)型（腔內(nèi)pH值7.2）后的典型記錄，我們通過(guò)向胞質(zhì)溶液添加特異性激活劑ML-SA1來(lái)激活TRPML1電流11。隨后，應(yīng)用非滲透性陽(yáng)離子NMDG導(dǎo)致內(nèi)向電流部分被阻斷，使反轉(zhuǎn)電位發(fā)生約30 mV的游走性變化（數(shù)據(jù)未顯示），這凸顯了TRPML1作為陽(yáng)離子選擇性通道的特性。

鑒于已知溶酶體離子通道的pH依賴性，以及某些通道在溶酶體酸性pH條件下的質(zhì)子滲透特性，我們采用管腔內(nèi)溶液交換法來(lái)測(cè)定野生型（WT）和過(guò)表達(dá)TRPML1溶酶體的pH敏感性（圖2A）。如圖2B所示，當(dāng)施加pH值更低的管腔內(nèi)溶液時(shí)，野生型和過(guò)表達(dá)TRPML1的溶酶體均表現(xiàn)出外向電流和內(nèi)向電流的增加。將觀察到的電流增幅歸一化至最大反應(yīng)值，并通過(guò)希爾方程擬合數(shù)據(jù)，得出在+100mV和-100mV條件下的EC50[pH]（±標(biāo)準(zhǔn)差）：野生型溶酶體分別為5.0±0.7和5.1±0.9，過(guò)表達(dá)TRPML1的溶酶體分別為6.1±0.7和5.8±0.9。我們還測(cè)定了典型成功率（野生型與過(guò)表達(dá)TRPML1溶酶體相似），在單次實(shí)驗(yàn)中對(duì)166個(gè)溶酶體記錄施加了密封電阻>200MΩ、-100mV電流<-150pA的質(zhì)量篩選條件后，最終成功率為43.2%。

接下來(lái)，我們?cè)诠芮粌?nèi)pH值為7.2的條件下進(jìn)行了藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，使用了已知的激活劑（ML-SA1、MK6-83）和抑制劑（ML-SI3），如圖3A中SyncroPatch 384設(shè)備記錄的軌跡所示。為測(cè)定這些化合物的半數(shù)有效濃度（EC50），我們采用4個(gè)遞增濃度的ML-SA1進(jìn)行了累積劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，并在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)使用ML-SI3來(lái)抑制電流。實(shí)驗(yàn)（圖3B）。對(duì)類(lèi)似記錄數(shù)據(jù)進(jìn)行希爾方程擬合后的標(biāo)準(zhǔn)化響應(yīng)顯示，ML-SA1在+100mV和-100mV條件下的EC50值（±標(biāo)準(zhǔn)差）分別為5.5±2.9μM和4.8±2.9μM，而MK6-83的對(duì)應(yīng)值分別為1.8±1.2μM和2.5±1.3μM（圖3C）。兩種化合物在ML-SA1和MK6-83作用下的各電壓數(shù)據(jù)均未表現(xiàn)出顯著差異，這與文獻(xiàn)11,12,13報(bào)道數(shù)值相符。圖3D對(duì)比了TRPML1過(guò)表達(dá)溶酶體在-100mV時(shí)的電流分布：使用最高濃度ML-SA1（30.69μM）在腔內(nèi)pH7.2條件下激活產(chǎn)生的平均電流為-312pA（n=96），而腔內(nèi)酸性pH（4.5）激活產(chǎn)生的平均電流為-317pA（n=214）。經(jīng)t檢驗(yàn)，觀測(cè)數(shù)據(jù)無(wú)顯著差異，表明腔內(nèi)酸化與ML-SA1藥物激活具有相似的刺激效能。

結(jié)果：

固態(tài)膜片電泳技術(shù)（SSME）為深入分析和驗(yàn)證Oria Bioscience公司提供的LYSO前體制劑的通用性，我們采用了基于固態(tài)支撐膜電生理學(xué)的SURFE2R儀器系統(tǒng)。該技術(shù)兼容多種膜制備樣本（包括含有目標(biāo)蛋白TRPML1的溶酶體或其他細(xì)胞器），通過(guò)脂質(zhì)層將這些膜泡附著于直徑3毫米的金傳感器表面（圖4）。相較于膜片鉗技術(shù)，此方法不僅能在天然環(huán)境中研究溶酶體通道蛋白（如TMEM175）且無(wú)需依賴溶酶體膨脹，樣本更可保存數(shù)月而不影響記錄質(zhì)量或需持續(xù)維持細(xì)胞培養(yǎng)。SSME技術(shù)通過(guò)溶液交換提供底物或配體來(lái)激活轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白/通道蛋白，所產(chǎn)生電荷位移被檢測(cè)為瞬態(tài)電容電流并進(jìn)行后續(xù)分析。表1中我們?cè)敿?xì)對(duì)比了膜片鉗與SSME技術(shù)在方法論上的差異。

TRPML1是溶酶體上主要的Ca2+滲透通道6,7。因此，所有SSME實(shí)驗(yàn)都從施加2 mM Ca2+開(kāi)始，以刺激TRPML1介導(dǎo)的Ca2+電流。

圖3 A 展示了一個(gè)來(lái)自擴(kuò)大的（空泡化）分離溶酶體的SyncroPatch 384記錄示例，這些溶酶體過(guò)表達(dá)TRPML1通道蛋白，經(jīng)ML-SA1激活后被ML-SI3抑制。B 顯示在施加濃度遞增的ML-SA1后，于-100 mV電壓下記錄的電流變化，以及超過(guò)23分鐘時(shí)間過(guò)程中ML-SI3的抑制作用。C 箱形圖呈現(xiàn)了在微摩爾低濃度范圍內(nèi)，ML-SA1和MK6-83存在時(shí)，基于-100 mV平均電流響應(yīng)（希爾方程）計(jì)算得出的EC50值。D -100 mV下的電流分布顯示，在最高使用濃度（30.69 μM）的酸化處理或ML-SA1刺激后，未出現(xiàn)顯著差異（t檢驗(yàn)）。

隨后我們?cè)谝种苿┖驮鰪?qiáng)劑存在條件下重復(fù)鈣離子激活實(shí)驗(yàn)，通過(guò)調(diào)節(jié)鈣離子電流進(jìn)一步研究TRPML1的藥理學(xué)特性。圖5C顯示隨著ML-SA5濃度升高產(chǎn)生的劑量依賴性激活效應(yīng)，導(dǎo)致鈣離子電流逐步增強(qiáng)。圖5E展示了在SURFE2R N1平臺(tái)上未添加化合物時(shí)，電流強(qiáng)度相對(duì)于鈣離子響應(yīng)的歸一化數(shù)據(jù)。通過(guò)希爾方程擬合得出EC50值為22±9 nM，該數(shù)值略低于先前在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤組織中報(bào)道的研究值14。值得注意的是，在未過(guò)表達(dá)TRPML1的分離溶酶體記錄中，ML-SA5對(duì)電流未產(chǎn)生顯著影響，這凸顯了該檢測(cè)體系的高靈敏度。

我們將該檢測(cè)方法轉(zhuǎn)移至高通量SURFE2R 96SE平臺(tái)。結(jié)合高達(dá)99%的成功率，該方法能在不影響藥理學(xué)參數(shù)的前提下（圖5F，EC50=33±22 nM），實(shí)現(xiàn)檢測(cè)樣本量的大幅提升（單板可完成95次記錄）。在相同條件下，我們使用N1平臺(tái)研究了ML-SI3的抑制效應(yīng)，測(cè)得IC50值為0.74±0.1 μM，該結(jié)果與文獻(xiàn)15報(bào)道高度吻合。這些數(shù)據(jù)與SyncroPatch 384平臺(tái)的結(jié)果相互印證，證實(shí)了這些化合物對(duì)TRPML1的特異性作用。無(wú)論是APC還是SSME技術(shù)，對(duì)ML-SA1、MK6-83及ML-SI3的檢測(cè)結(jié)果均與文獻(xiàn)報(bào)道一致。據(jù)我們所知，此前尚未有關(guān)于ML-SA5處理分離細(xì)胞的EC50值報(bào)道。

結(jié)論：

我們?cè)诖耸状螆?bào)告使用來(lái)自O(shè)ria Bioscience的新鮮分離、運(yùn)輸即用型（無(wú)需細(xì)胞培養(yǎng)）溶酶體。通過(guò)APC和SSME兩種不同技術(shù)成功對(duì)樣本進(jìn)行表征，證實(shí)其適用于高通量研究。由于SURFE2R 96SE設(shè)備接近100%的成功率，該技術(shù)極其適合制藥行業(yè)的藥物開(kāi)發(fā)應(yīng)用。Oria Bioscience提供的樣本是高度純凈、均質(zhì)且可靠的優(yōu)質(zhì)溶酶體來(lái)源，我們可跨設(shè)備使用這些樣本獲得與文獻(xiàn)相符的EC/IC50值。這有助于更深入理解溶酶體通道功能及其作為治療靶區(qū)的作用，同時(shí)規(guī)避了使用異源表達(dá)系統(tǒng)（在質(zhì)膜表達(dá)這些通道）或間接記錄方法可能產(chǎn)生的局限性。我們采用該方法記錄了野生型及TRPML1過(guò)表達(dá)溶酶體的電流，發(fā)現(xiàn)TRPML1過(guò)表達(dá)使溶酶體內(nèi)腔pH敏感性向堿性方向偏移約1個(gè)pH單位。通過(guò)特異性藥理試劑（ML-SA1/5、MK6-83、ML-SI3）和嚴(yán)格質(zhì)量控制，我們驗(yàn)證了記錄數(shù)據(jù)的有效性。在SURFE2R儀器上的實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)：使用同一批次未擴(kuò)增的溶酶體樣本即可驗(yàn)證TRPML1的藥理特性，而未過(guò)表達(dá)溶酶體的對(duì)照記錄中未檢測(cè)到信號(hào)。

我們的研究結(jié)果明確表明，將NPC-384T納米S型芯片與SyncroPatch 384低細(xì)胞密度方法相結(jié)合，并配合使用SURFE2R儀器，將為溶酶體通道的電生理研究提供高效且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的技術(shù)手段。

我們期待這一技術(shù)能夠擴(kuò)展至其他類(lèi)型細(xì)胞器和細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中表達(dá)的各種離子通道，正如Santinho等人5的研究所展示的那樣，這凸顯了Nanion設(shè)備廣泛的應(yīng)用潛力。

圖4 A 鍍金3毫米SURFE2R傳感器的示意圖，附著有多個(gè)溶酶體。B 覆蓋金傳感器的固體支撐膜（SSM）放大示意圖。在0 mV條件下，通過(guò)2 mM Ca2+濃度躍升刺激TRPML1介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流。由此產(chǎn)生的瞬態(tài)電流通過(guò)溶酶體膜與SSM的電容耦合被記錄，峰值電流對(duì)應(yīng)穩(wěn)態(tài)條件下通過(guò)TRPML1的Ca2+通量。

方法：

溶酶體分離 LYSO-Preps 包含擴(kuò)大（1μM vacuolin）或未擴(kuò)大的溶酶體，數(shù)量為2x107個(gè)（用于APC）或蛋白濃度約2mg/ml（用于SSME）。LYSO-Preps由Oria Bioscience（https://www.oriabs.com）及其專有平臺(tái)生產(chǎn)提供，該平臺(tái)按照先前描述的方法5從HEK細(xì)胞中分離溶酶體。

方法：電生理學(xué)APC全細(xì)胞膜片鉗記錄按照Nanion公司SyncroPatch 384的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。所有實(shí)驗(yàn)均在室溫（21°C）條件下完成，使用平面硼硅酸鹽玻璃芯片及NPC-384T納米S型芯片（1x；產(chǎn)品編號(hào)：22 2111）。溶酶體在施加電壓斜坡協(xié)議前保持0 mV的鉗制電位，該協(xié)議在1秒內(nèi)從-100 mV線性變化至100 mV。此操作每5秒重復(fù)一次，采樣頻率為5 KHz，未進(jìn)行漏電流扣除。為估算半數(shù)有效濃度（EC50），電流值均歸一化至最大響應(yīng)值，并通過(guò)希爾方程進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合。更詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)流程可應(yīng)要求提供。

方法：

電生理學(xué)SSMESSME記錄采用SURFE2R N1儀器和SURFE2R 96SE高通量設(shè)備（該設(shè)備可同時(shí)測(cè)量96個(gè)傳感器，成功率接近100%）在持續(xù)溶液流條件下完成。對(duì)于SURFE2R N1，每個(gè)傳感器通過(guò)添加約0.5微克總蛋白（采用布拉德福德法測(cè)定）進(jìn)行制備。SURFE2R 96SE的傳感器板包被和化合物板制備則根據(jù)Nanion標(biāo)準(zhǔn)方案直接在儀器上完成。通過(guò)將溶液從非激活液（含額外4 mM氯化膽堿）切換至激活液（補(bǔ)充2 mM氯化鈣），在0 mV條件下刺激TRPML1介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流。增強(qiáng)劑和阻斷劑通過(guò)用1 ml非激活液沖洗傳感器并在測(cè)量前孵育3分鐘的方式添加，這些物質(zhì)在測(cè)量過(guò)程中同時(shí)存在于非激活液和激活液中。更詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)流程可應(yīng)要求提供。

圖5 A SURFE2R N1平臺(tái)采用單孔格式進(jìn)行SSME記錄（左圖）。用于SURFE2R N1記錄的3毫米傳感器（中圖）。SURFE2R N1控制軟件1.7.0.2界面截圖（右圖）。B SURFE2R 96SE平臺(tái)采用高通量格式進(jìn)行SSME記錄（左圖）。配合SURFE2R 96SE使用的96傳感器微孔板（中圖）。SURFControl 96 1.7軟件界面截圖（右圖）。C 使用相同3毫米傳感器記錄的代表性電流軌跡，測(cè)試不同濃度的TRPML1增強(qiáng)劑ML-SA5。D 將SURFE2R N1記錄的峰值電流歸一化至未添加ML-SI3時(shí)的峰值電流，取平均值獲得均值與標(biāo)準(zhǔn)差。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)希爾方程擬合數(shù)據(jù)獲得IC50和Imax值。使用未過(guò)表達(dá)TRPML1的HEK293細(xì)胞純化溶酶體進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)與分析，最高抑制劑濃度下未觀察到顯著效應(yīng)。最高阻斷劑濃度下的殘余電流（Imin）反映鈣離子結(jié)合膜產(chǎn)生的背景電流，可扣除后獲得TRPML1凈電流。E 將SURFE2R N1記錄的峰值電流歸一化至未添加ML-SA5時(shí)的峰值電流，取平均值獲得均值與標(biāo)準(zhǔn)差。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)希爾方程擬合數(shù)據(jù)獲得EC50和Imax值。F 使用SURFE2R 96SE平臺(tái)重復(fù)E項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，擬合算法與歸一化方式同E。