流式細(xì)胞分析的臨床應(yīng)用日益廣泛,常用于淋巴細(xì)胞亞群分析、白血病免疫表型分析、腫瘤治療中的方案選擇及療效評(píng)估等。檢測(cè)的樣本多為外周血、骨髓、各種體液(如腦脊液、胸水、腹水)及人體的組織(淋巴結(jié)、脾臟、肝)。制備出合格的分散單細(xì)胞將極大促進(jìn)流式細(xì)胞分析的規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化工作。接下來(lái)為大家介紹流式各種樣本制備的流程和關(guān)鍵注意事項(xiàng),助您實(shí)驗(yàn)事半功倍!
一
外周血、骨髓樣本制備
① 樣本采集與保存:
使用EDTA或肝素抗凝,12h內(nèi)檢測(cè)可室溫保存,24-48h處理需4℃保存。
② 紅細(xì)胞裂解
取100-200μl抗凝全血/骨髓,加入2ml紅細(xì)胞裂解液,輕柔混勻,外周血室溫孵育裂解10min,骨髓裂解5-8min;特殊樣本可增加稀釋度或延長(zhǎng)裂解時(shí)間,加入PBS至滿管,300-400g離心5min,棄上清以終止裂解;重復(fù)PBS離心洗滌,去除碎片。
骨髓樣本粘稠需用PBS稀釋后再裂解;若紅細(xì)胞殘留,可重復(fù)裂解1次。
推薦使用商品化裂解液,不同品牌以具體說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。
③ 抗體染色
胞膜表面染色:根據(jù)Panel用量加入5-20 μl不同熒光素標(biāo)記的抗體,避光室溫孵育15min,PBS離心洗滌后,重懸于PBS中,若不及時(shí)檢測(cè),可加多聚甲醛固定后避光4 ℃保存,待上機(jī)檢測(cè)。
胞內(nèi)染色:按照不同廠家的說(shuō)明書(shū),先標(biāo)記膜表面抗體,再添加破膜劑處理10min,后加入胞內(nèi)抗體,避光室溫孵育30min,洗滌后重懸。
④ 注意事項(xiàng):
熒光染色過(guò)程可以有不同的流程順序:染色-裂解-洗滌,染色-裂解-免洗,裂解-染色-洗滌。不同的染色流程對(duì)流式樣本的熒光強(qiáng)度有明顯影響,根據(jù)多中心數(shù)據(jù)表明,染色后裂解繼而洗滌,可以改善FSC、SSC的CV,得到最高的熒光強(qiáng)度。
二
組織樣本制備
① 樣本采集:
新鮮組織樣本置于生理鹽水或PBS中,室溫保存,盡量在12 h內(nèi)處理樣本;若無(wú)法及時(shí)處理,4℃保存,保存時(shí)間最好不要超過(guò)48 h。
② 常用方法
方法 | 操作 |
剪碎研磨 | 眼科剪將組織剪成極小塊后注射器針芯研磨成勻漿,PBS混勻后,200-300目濾網(wǎng)過(guò)濾,離心去上清,PBS洗滌后調(diào)整至所需濃度備用。 |
網(wǎng)搓 | 剪碎的組織在300目尼龍網(wǎng)上,邊搓邊PBS沖洗,收集懸液,離心去上清,PBS洗滌后調(diào)整至所需濃度備用。 |
研磨 | 組織剪成小塊放入組織研磨器加PBS研磨至勻漿,加PBS沖洗后收集懸液再過(guò)200-300目尼龍網(wǎng),離心沉淀去上清,PBS洗滌后調(diào)整至所需濃度備用。 |
蛋白酶消化 | 組織塊用PBS漂洗后剪成小塊,加入蛋白酶溶液,轉(zhuǎn)至三角燒瓶于37 ℃水浴或者恒溫箱中消化一定時(shí)間,每隔5-10min震蕩,直至完成消化。消化液經(jīng)200-300目濾網(wǎng)過(guò)濾后離心5min, 去上清,PBS洗滌后調(diào)整至所需濃度備用。 |
③ 注意事項(xiàng):
不同組織樣本根據(jù)不同檢測(cè)項(xiàng)目要求需選用不同的處理方法。
酶處理注意時(shí)間、PH值、濃度等影響,且根據(jù)組織類型選擇合適的酶。
三
體液樣本制備
① 樣本采集與保存:
收集的樣本至于肝素抗凝管,室溫保存需12h內(nèi)處理,若無(wú)法及時(shí)處理,4℃保存,保存時(shí)間最好不要超過(guò)48 h。
② 制備方法:
體液樣本離心5min,收集細(xì)胞沉淀,經(jīng)PBS離心洗滌,若懸液有沉淀,可經(jīng)200-300目濾網(wǎng)過(guò)來(lái)后再洗滌,最后用PBS調(diào)整至所需濃度備用。
③ 注意事項(xiàng):
腦脊液需高速離心濃縮細(xì)胞,胸腹水血性樣本先裂解紅細(xì)胞。
使用錐形底離心管,輕柔吹打以防細(xì)胞丟失。
隨著技術(shù)發(fā)展,目前已經(jīng)有自動(dòng)化樣本處理儀如貝克曼CellMek SPS應(yīng)用于臨床,這類儀器的使用會(huì)大大提高檢測(cè)效率和分析精密度。各位感興趣的小伙伴如需了解更多詳細(xì)信息,歡迎聯(lián)系技術(shù)支持和業(yè)務(wù)代表獲取詳細(xì)資料。
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