本研究探討了人類外周血單核細(xì)胞（hPBMCs）固定化對(duì)其在阿爾茨海默病細(xì)胞模型中依賴于Аβ42 聚集物的促炎狀態(tài)的影響。結(jié)果顯示，固定化細(xì)胞對(duì)異源刺激的基本指標(biāo)水平及響應(yīng)強(qiáng)度顯著高于懸浮細(xì)胞，且β1 整合素在細(xì)胞 - 基質(zhì)粘附中起關(guān)鍵作用，阻斷后可抑制 rAβ42 誘導(dǎo)的 TNFα 和 Aβ40 積累，提示細(xì)胞粘附因素對(duì)研究結(jié)果的重要性130。

一、研究背景與目的

1.阿爾茨海默病（AD）病理基礎(chǔ)：主要與淀粉樣變性和炎癥相關(guān)，Aβ40 和 Aβ42 是關(guān)鍵的淀粉樣 β 肽異構(gòu)體，其中 Aβ42 更易聚集且致病性更強(qiáng)2。

2.研究意義：外周血單核細(xì)胞（PBMC）常被用于評(píng)估 AD 相關(guān)分子（如 Aβ42）引發(fā)的細(xì)胞因子變化，但傳統(tǒng)懸浮培養(yǎng)未考慮細(xì)胞粘附因素，可能與體內(nèi)環(huán)境存在差異，影響研究結(jié)果12。

3.研究目的：探究hPBMCs 的細(xì)胞 - 基質(zhì)粘附對(duì)其體外促炎狀態(tài)的影響，比較懸浮細(xì)胞與固定化細(xì)胞對(duì) Aβ42 刺激的響應(yīng)，并分析 β1 整合素的作用13。

二、材料與方法

1.細(xì)胞來源與處理

1.來源：健康成年捐贈(zèng)者的hPBMCs，經(jīng) Ficoll–Hypaque 方法分離，保存在 CryoStor? CS10 培養(yǎng)基中，細(xì)胞活力 92.0%，濃度 1.5×10?/ml456。

2.培養(yǎng)方式：

l懸浮培養(yǎng)：RPMI-1640 培養(yǎng)基（含 10.0% 胎牛血清等），24 孔板培養(yǎng) 24 小時(shí)（37.0±0.1°C、5.0±0.1% CO?）78。

l固定化培養(yǎng)：CERO 生物反應(yīng)器用于固定化細(xì)胞的培養(yǎng)，控制培養(yǎng)環(huán)境參數(shù)。采用GEM 技術(shù)，將細(xì)胞固定在含 1.0% I 型膠原蛋白、0.5% RGD 肽和 1.0% 纖連蛋白的藻酸鹽微載體表面，在生物反應(yīng)器中培養(yǎng) 24 小時(shí)91011。

CERO 3D細(xì)胞(類器官)生物反應(yīng)器

1.實(shí)驗(yàn)處理

1.rAβ42 刺激：濃度 15nM，超聲處理分散聚集體后加入細(xì)胞培養(yǎng)體系1213。

2.β1 整合素阻斷：hPBMCs 與抗 β1 整合素抗體（1:200）在 37°C 孵育 30 分鐘后進(jìn)行固定化培養(yǎng)1415。

2.檢測方法

1.細(xì)胞因子（TNFα、IL-1β）和 Aβ40 含量：采用 ELISA 試劑盒，在 FL600 微孔板多模式閱讀器上檢測，結(jié)果以 ng/g 總蛋白表示161718。

2.活細(xì)胞成像：使用激光掃描共聚焦顯微鏡（FV10i-LIV），通過熒光探針 CRANAD-2 和 MCAAD-3 分別觀察 rAβ42 和 Aβ40 的定位與積累，計(jì)算比值指數(shù) R（rAβ42/Aβ40）192021。

3.統(tǒng)計(jì)分析：單因素方差分析（ANOVA）結(jié)合 Tukey 多重比較檢驗(yàn)，p<0.05 為差異顯著22。

三、研究結(jié)果

1.細(xì)胞因子和Aβ40 的變化

1.無rAβ42 時(shí)：TNFα 和 Aβ40 含量在 24 小時(shí)內(nèi)無顯著變化，IL-1β 含量在 24 小時(shí)后顯著降低（懸浮細(xì)胞：285.2±15.6 ng/g；固定化細(xì)胞：304.1±15.5 ng/g）232627。

2.有rAβ42 時(shí)：

lTNFα 含量增加，24 小時(shí)時(shí)懸浮細(xì)胞達(dá) 108.3±11.5 ng/g，固定化細(xì)胞達(dá) 161.6±9.2 ng/g2627。

lAβ40 含量增加，24 小時(shí)時(shí)懸浮細(xì)胞達(dá) 67.5±5.1 ng/g，固定化細(xì)胞達(dá) 89.2±4.2 ng/g2627。

lIL-1β 未觀察到積累23。

2.肽的定位與比值變化

1.Aβ40 在細(xì)胞質(zhì)中積累，rAβ42 在細(xì)胞膜外表面聚集24。

2.比值指數(shù)R（rAβ42/Aβ40）：懸浮細(xì)胞從 0.08 升至 0.76，固定化細(xì)胞從 0.06 升至 0.42，固定化細(xì)胞比值更低25。

3.β1 整合素阻斷的影響：阻斷后，固定化細(xì)胞中TNFα 和 Aβ40 的積累顯著受抑制（TNFα：72.8±5.5 ng/g；Aβ40：77.9±5.5 ng/g），但仍高于懸浮細(xì)胞2829。

四、結(jié)論

1.固定化細(xì)胞對(duì)異源Aβ42 刺激的基本指標(biāo)水平及響應(yīng)強(qiáng)度顯著高于懸浮細(xì)胞30。

2.細(xì)胞- 基質(zhì)粘附（由 β1 整合素介導(dǎo)）可增強(qiáng) hPBMCs 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和合成活性30。

3.傳統(tǒng)懸浮培養(yǎng)未考慮細(xì)胞粘附因素，可能導(dǎo)致研究健康或AD 患者來源的 hPBMCs 對(duì)外源性刺激的反應(yīng)時(shí)得出錯(cuò)誤結(jié)論30。

關(guān)鍵問題：

問題：固定化培養(yǎng)的hPBMCs 與懸浮培養(yǎng)的 hPBMCs 對(duì) rAβ42 刺激的響應(yīng)存在哪些主要差異？
答案：主要差異體現(xiàn)在響應(yīng)強(qiáng)度上，固定化細(xì)胞的TNFα 和 Aβ40 積累量顯著高于懸浮細(xì)胞。例如，與 rAβ42 孵育 24 小時(shí)后，固定化細(xì)胞的 TNFα 含量（161.6±9.2 ng/g）高于懸浮細(xì)胞（108.3±11.5 ng/g），Aβ40 含量（89.2±4.2 ng/g）也高于懸浮細(xì)胞（67.5±5.1 ng/g）；同時(shí)，固定化細(xì)胞的 rAβ42/Aβ40 比值上升幅度小于懸浮細(xì)胞，且細(xì)胞內(nèi)肽的分布異質(zhì)性更顯著252627。

問題：β1 整合素在 hPBMCs 的固定化效應(yīng)中起到了怎樣的作用？
答案：β1 整合素介導(dǎo)了細(xì)胞與基質(zhì)的粘附，對(duì)固定化 hPBMCs 的促淀粉樣蛋白生成和促炎狀態(tài)有重要影響。與 β1 整合素阻斷抗體孵育后，固定化細(xì)胞在 rAβ42 處理下的 TNFα 和 Aβ40 積累顯著受抑制，但仍高于懸浮細(xì)胞，表明 β1 整合素是細(xì)胞 - 基質(zhì)粘附增強(qiáng)細(xì)胞響應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)之一152829。

問題：本研究為何認(rèn)為傳統(tǒng)懸浮培養(yǎng)可能導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)論？
答案：因?yàn)閼腋∨囵B(yǎng)未包含細(xì)胞通過粘附激活的因素，而細(xì)胞間及細(xì)胞- 基質(zhì)粘附是 hPBMCs 活化的關(guān)鍵因素，在體內(nèi)始終存在。例如，單核細(xì)胞產(chǎn)生自由氧種類的強(qiáng)度受整合素粘附受體調(diào)控，且 AD 患者的 PBMC 在懸浮培養(yǎng)時(shí)對(duì) β- 淀粉樣肽刺激表現(xiàn)出抵抗性，忽視細(xì)胞粘附可能導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞對(duì)外源性刺激的反應(yīng)評(píng)估不準(zhǔn)確230。

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