基于上述研究現(xiàn)狀，解放軍總醫(yī)院付小兵院士/張翠萍團(tuán)隊(duì)通過(guò)實(shí)驗(yàn)鑒定出一種治療性circRNA，并將其加載到工程化MSC來(lái)源的細(xì)胞外囊泡（sEV）中，在臨床前模型中研究其治療效果5。相關(guān)研究報(bào)道以“circCDK13-loaded small extracellular vesicles accelerate healing in preclinical diabetic wound models”為題，發(fā)表在Nature Communications上。
circCDK13在糖尿病傷口中下調(diào)
a. 糖尿病足潰瘍 （DFU） 與正常傷口 （NW） 中具有顯著表達(dá)差異的前 40 個(gè)circRNA 熱圖。紅色代表上調(diào)的 circRNA，藍(lán)色代表下調(diào)的 circRNA。
b. 從微陣列數(shù)據(jù)中提取的 circCDK13 的表達(dá)水平對(duì)比。
c.RT-qPCR分析結(jié)果顯示，circCDK13在糖尿病小鼠傷口中的表達(dá)下調(diào)。正常野生型小鼠傷口(WWs),糖尿病小鼠傷口(DWs)。
d,e.用不同濃度的AGE-BSA處理人類真皮成纖維細(xì)胞( HDF) 和人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(HEKs) 中 circCDK13 的相對(duì)表達(dá)水平。
作者通過(guò)對(duì)比糖尿病傷口與正常傷口的circRNA表達(dá)差異情況，鑒定到一個(gè)在糖尿病傷口中顯著下調(diào)的circRNA——circCDK13。通過(guò)qPCR和模擬糖尿病傷口的體外微環(huán)境的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，同樣也發(fā)現(xiàn)circCDK13存在明顯的下調(diào)。通過(guò)測(cè)序、Rnase降解、放線菌素D處理等一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該circRNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性。
circCDK13在體外促進(jìn)HDFs
和HEKs的增殖和遷移
b,c. RT-qPCR結(jié)果顯示，兩種靶向circCDK13反剪接位點(diǎn)的siRNA顯著降低了HDFs和HEKs中circCDK13的表達(dá)水平。
d,e. CCK-8 測(cè)定表明，敲低circCDK13會(huì)抑制 HDF 和 HEK 的活力。
g,h. RT-qPCR檢測(cè)HDFs和HEKs中過(guò)表達(dá)后的circCDK13水平。
i, j. CCK-8 測(cè)定表明，circCDK13 的過(guò)表達(dá)增加了 HDF 和 HEK 的活力
k. EdU 摻入測(cè)定以評(píng)估 HDF （ HEK結(jié)果未展示） 中的 DNA 合成。紅色熒光代表 EdU 陽(yáng)性細(xì)胞，而藍(lán)色熒光代表總細(xì)胞。
m. 進(jìn)行傷口愈合試驗(yàn)，測(cè)定 HDF （ HEK結(jié)果未展示）的運(yùn)動(dòng)性。
o. HDF（ HEK結(jié)果未展示）transwell遷移試驗(yàn)的代表性圖像。
在人類真皮成纖維細(xì)胞（HDF）和人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞（HEK）中，利用siRNA技術(shù)和過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染技術(shù)，通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)分析表明敲低circCDK13 導(dǎo)致細(xì)胞活力降低，增高的 circCDK13 導(dǎo)致細(xì)胞活力顯著增加。EdU陽(yáng)性細(xì)胞的百分比因circCDK13敲低而降低，因circCDK13表達(dá)而增加。劃痕和transwell試驗(yàn)結(jié)果表明circCDK13敲低會(huì)降低細(xì)胞的遷移能力，因circCDK13表達(dá)而增加細(xì)胞的遷移能力。這些數(shù)據(jù)表明circCDK13在體外能夠影響細(xì)胞的活力、增殖和遷移。此外，作者也驗(yàn)證了circCDK13而非CDK13蛋白在調(diào)節(jié)HDF和HEK的增殖和遷移中起著重要作用。
circCDK13與IGF2BP3相互作用
a. RNA pull-down 示意圖。
f. NPDock繪制 circCDK13 和 IGF2BP3 蛋白之間的連接示意圖。
g. circCDK13 與 IGF2BP3 之間的相互作用通過(guò) RNA pull-down 和 Western blot 測(cè)定法進(jìn)行驗(yàn)證。GAPDH作為陰性對(duì)照。
h. RIP分析驗(yàn)證了circCDK13與IGF2BP3之間的相互作用。
i. RT-qPCR分析IGF2BP3 RIP產(chǎn)物中circCDK13的相對(duì)富集。
j. FISH 和免疫熒光共染色顯示 circCDK13（紅色）與 HDF 和 HEK 中的IGFB2P3（綠色）共定位。
最近的研究表明一些細(xì)胞質(zhì)circRNA可以與RNA結(jié)合蛋白（RBP）相互作用并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)功能6。為了進(jìn)一步闡明circCDK13促進(jìn)HDFs和HEKs增殖和遷移的分子機(jī)制，通過(guò)RNApull-down實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行電泳、銀染和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜等測(cè)定發(fā)現(xiàn)IGF2BP3是與circCDK13相互作用的潛在RBP。通過(guò)RNA pull-down 和RIP-qPCR以及RNA FISH免疫熒光測(cè)定進(jìn)一步證實(shí)了circCDK13與IGF2BP3之間的結(jié)合。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)還表明，IGF2BP3的KH結(jié)構(gòu)域、circCDK13的“ACAAACA”序列和的m6A修飾對(duì)于 circCDK13 和 IGF2BP3 之間的相互作用至關(guān)重要，circCDK13與IGF2BP3之間的相互作用還可以增強(qiáng)彼此的穩(wěn)定性。后續(xù)的一系列挽救實(shí)驗(yàn)則證明circCDK13和IGF2BP3協(xié)同增強(qiáng)c-MYC和CD44mRNA的穩(wěn)定性，提高c-MYC和CD44蛋白水平，從而增強(qiáng)HDFs和HEKs的增殖和遷移?？傊@些結(jié)果從分子水平上解釋了circRNA的調(diào)控機(jī)制和原理。
circCDK13OE-sEVs
促進(jìn)了HDF和HEK的增殖和遷移
N-sEVs和circCDK13OE-sEVs的TEM顯微照片(b), NTA測(cè)量的大小分布和濃度分布(c) ,蛋白的表達(dá)情況對(duì)比(d)。
不同處理組后的：
i. 傷口愈合試驗(yàn)，測(cè)量 HDF 和 HEK 的運(yùn)動(dòng)性。
k. HDFs和HEKs的transwell遷移試驗(yàn)遷移細(xì)胞的數(shù)量。
m. CCK-8測(cè)定HDF 和 HEK的細(xì)胞活性。
n. EdU 摻入試驗(yàn)里HDF 和 HEK 中EdU 陽(yáng)性細(xì)胞百分比。
o. HDF 和 HEK 中 IGF2BP3、c-MYC、CD44 和細(xì)胞周期蛋白 D1 蛋白表達(dá)水平的蛋白質(zhì)印跡分析。
為了提高circCDK13在傷口愈合和組織再生中的潛在應(yīng)用，構(gòu)建了含有更高豐度的circCDK13工程化sEV。作者使用 circCDK13 慢病毒或載體感染人胎盤絨毛膜衍生的 MSC(CP-MSCs)，成功制備了過(guò)表達(dá)circCDK13的工程化sEV。不同的處理組的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：circCDK13OE-sEVs 具有最強(qiáng)的拮抗AGE-BSA或HG（高糖環(huán)境）抑制 HDF 和 HEK 的增殖和遷移的效果。蛋白表達(dá)的結(jié)果表明：circCDK13OE-sEVs通過(guò)介導(dǎo)circCDK13-IGF2BP3-CD44/c-MYC信號(hào)通路來(lái)達(dá)到這種拮抗效果。
circCDK13OE-sEVs加速二型（b,g）
和一型糖尿病小鼠(c,h)的傷口愈合
b,c 采用不同的治療方法后，傷口在第 0、3、7、14 和 21 天糖尿病傷口的大體視圖，和傷口閉合率的定量評(píng)估（g,h）。
最后，為了驗(yàn)證工程化的sEVs的治療效果。作者分別在I型糖尿病大鼠模型和II型糖尿病小鼠模型中構(gòu)建了皮膚損傷傷口模型，并在傷口處施用了工程化的sEVs，結(jié)合H&E染色和Masson三色染色，對(duì)傷口閉合率、傷口寬度、上皮舌長(zhǎng)等定量分析，結(jié)果顯示circCDK13OE-sEVs能顯著提升了傷口愈合速度。而且在II型糖尿病小鼠模型中治療后第21天，circCDK13OE-sEVs治療的糖尿病傷口中能夠觀察到成熟的皮膚結(jié)構(gòu)，如毛囊和皮脂腺。而在I型糖尿病大鼠模型中，circCDK13OE-sEVs治療的小鼠在再上皮化、肉芽組織形成和皮膚附屬物再生方面具有更顯著的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，circCDK13OE-sEVs治療組的IGF2BP3, c-MYC, and CD44的蛋白表達(dá)也高于其他治療組。
總之，這項(xiàng)研究中，作者以難愈合的糖尿病傷口為研究對(duì)象，探究了調(diào)控糖尿病傷口愈合的潛在circRNA的功能和作用機(jī)制。并在MSC細(xì)胞中過(guò)表達(dá)特定circRNA，通過(guò)差速超速離心分離得到相應(yīng)的工程化sEVs。在臨床前模型中，驗(yàn)證了工程化sEVs對(duì)糖尿病傷口愈合的促進(jìn)作用。這項(xiàng)工作邏輯嚴(yán)謹(jǐn)、數(shù)據(jù)完整、實(shí)驗(yàn)方法可靠、論證過(guò)程夯實(shí)可信，是一篇值得我們學(xué)習(xí)的研究論文。更多內(nèi)容，可以閱讀原文。
Tips: 工程化外泌體的制備
在T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)CP-MSCs， 5% CO2的濕潤(rùn)氣體中37℃進(jìn)行孵育。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到60% - 70%的融合度時(shí)，將它們與載體或circCDK13慢病毒共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入2 μg/ml的嘌呤霉素，獲得穩(wěn)定的菌株。通過(guò)差速離心，從CP-MSCs或circCDK13-CP-MSCs的上清液中制備sEVs（參考下圖）。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在4°C下上清液經(jīng)過(guò)一系列不同速度和時(shí)間的離心步驟：300 g離心10分鐘，3000 g離心15分鐘，10000 g離心60分鐘，以去除細(xì)胞和碎片，然后使用0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾。最后使用XPN-100超離心機(jī)(Beckman Coulter)在4°C下，以200,000 g超離心90分鐘。隨后，將沉淀顆粒重懸于PBS中，再次以200,000 g超離心90分鐘。最后，將所得沉淀顆粒重懸在PBS中進(jìn)行進(jìn)一步研究。
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1. Etiology, epidemiology, and disparities in the burden of diabetic foot ulcers.
2. Impairment of human keratinocyte mobility and proliferation by advanced glycation end products-modified BSA.
3. Circular RNA signatures of human healing and non-healing wounds.
4. The application of mesenchymal stromal cells (MSCs) and their derivative exosome in skin wound healing: a comprehensive review.
5. CircCDK13-loaded small extracellular vesicles accelerate healing in preclinical diabetic wound models.
6. CircHERC1 promotes non-small cell lung cancer cell progression by sequestering FOXO1 in the cytoplasm and regulating the miR-142-3p-HMGB1 axis
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