TRIzol試劑
1977年,科學(xué)家 Axel Ullrich 和他的同事們提出使用異硫氰酸胍(Guanidine Thiocyanate)用于 RNA 的分離純化,至1990 年,優(yōu)化該方法后,推出商業(yè)化的 TRIzol 試劑。
賽默飛TRIzol試劑是一種即用型試劑,用于在1小時(shí)內(nèi)從人類、動(dòng)物、植物、酵母或細(xì)菌來(lái)源的細(xì)胞和組織樣本中提取高質(zhì)量的總RNA(以及DNA和蛋白質(zhì)),TRIzol試劑在樣本勻漿化時(shí),可以破壞細(xì)胞,溶解細(xì)胞組分,同時(shí)高效的抑制RNA酶的活性,從而維持RNA的完整性。
TRIzol無(wú)氯仿解決方案
由于在TRIzol試劑的提取過(guò)程中,需要使用氯仿,而氯仿具有揮發(fā)性,會(huì)對(duì)眼睛、呼吸道、皮膚和黏膜造成刺激,因此迫切需要一種無(wú)氯仿解決方案。經(jīng)過(guò)賽默飛科學(xué)家的不懈探索,發(fā)現(xiàn)了1-溴-3-氯丙烷(1-Bromo-3-chloropropane ,BCP)可以替代氯仿,搭配TRIzol試劑提取RNA,接下來(lái),小編就和大家一睹為快——TRIzol無(wú)氯仿提取RNA的效果。
操作流程
在樣本進(jìn)行勻漿化時(shí),加入0.2mL氯仿或者0.1mL BCP,進(jìn)行RNA提取。
圖1. 操作流程示意圖,詳細(xì)步驟如下:
加1mL TRIzol試劑,裂解樣本,室溫孵育5min。
加0.2 mL氯仿或 0.1 mL BCP,振蕩混勻,孵育3min。
在4°C下12000×g離心樣本15min。
取約500μL上清液至新樣本管中。
加等樣本體積的異丙醇,顛倒混勻,在4°C下孵育10min。
在4°C下12000×g離心10min,棄上清。
加1mL 75%乙醇,重懸沉淀,短暫渦旋樣本,在4°C下7500×g離心5min,棄上清液。此步驟重復(fù)一次。
干燥5-10min,加20-50μL RNase-Free水,在55°C的水浴孵育10min。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
分別使用氯仿和BCP對(duì)5mg和20mg的兔的肝臟和腦組織,按照TRIzol試劑的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA提取,每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù),對(duì)得到的RNA產(chǎn)物進(jìn)行含量、純度、完整性等進(jìn)行評(píng)估。
RNA含量和純度
圖2. Nanodrop檢測(cè)RNA的產(chǎn)量和純度
RNA完整性測(cè)定
圖3. Agilent 2100測(cè)定RNA完整性和計(jì)算RIN指標(biāo)
RT-qPCR分析
圖4. 對(duì)提取RNA進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)內(nèi)參基因:GAPDH和ACTA2,說(shuō)明BCP提取的RNA,與氯仿相比,內(nèi)參基因表達(dá)量無(wú)顯著差異。
圖5. 提取RNA進(jìn)行Xeno抑制性實(shí)驗(yàn),說(shuō)明,BCP和氯仿所提取出來(lái)的RNA不會(huì)擴(kuò)增抑制后續(xù)的RT-qPCR實(shí)驗(yàn),降低假陰性結(jié)果的可能性,確保RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果是準(zhǔn)確和可控的,再次佐證了可以使用BCP搭配TRIzol試劑使用。
小結(jié)
在有機(jī)法提取RNA的過(guò)程中,賽默飛無(wú)氯仿提取后的RNA,含量高,純度好,完整性指數(shù)高,可直接做后續(xù)的RT-qPCR實(shí)驗(yàn)。
TRIzol開(kāi)學(xué)季促銷
為了助力科研er順利開(kāi)啟新學(xué)期,賽默飛如火如荼地展開(kāi)“開(kāi)學(xué)季促銷”活動(dòng):
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