膿毒癥（Sepsis）是由病原微生物侵入人體引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征（Systemic  inflammatory response syndrome, SIRS），常見于重癥監(jiān)護病房（Intensive Care Unit， ICU），死亡率高達 30%～50%。膿毒癥是由宿主對感染的反應(yīng)失調(diào)，反應(yīng)表現(xiàn)為喪失特異性，功能紊亂，導(dǎo)致多器官衰竭等癥狀并且病死率高，延遲診斷及治療會顯著增加膿毒癥患者住院時間，導(dǎo)致抗生素的濫用，增加醫(yī)療費用。及時識別診斷進行早期治療對膿毒癥患者的預(yù)后具有非常重要的意義。

白細胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）正常人體生理濃度很低（＜10 pg/mL），受到感染后IL-6水平會迅速升高，并且這種升高發(fā)生的時間比 PCT 早得多。1小時內(nèi)開始升高，2小時后可達高峰，由于 IL-6出現(xiàn)時間早，具有高敏感、高特異性等優(yōu)點，可以被用于膿毒癥的早期診斷，是膿毒癥可行性生物標(biāo)志物。

圖1 SERS磁反應(yīng)檢測白細胞介素-6實驗原理圖

利用上海生產(chǎn)的Portman785nm便攜式拉曼光譜儀并采用三明治夾心法原理的方法（實驗原理如圖1所示），制備嵌有拉曼報告分子的金核銀殼基底材料（Au@4MBA@Ag NPs），通過標(biāo)記抗體，檢測時與抗原形成雙抗夾心結(jié)構(gòu)，之后利用鏈霉親和素（Streptavidin，SA）和生物素系統(tǒng)（SA-Biotin）特定的反應(yīng)，夾心結(jié)構(gòu)迅速被SA磁珠捕獲，通過外部施加磁場富集磁珠，拉曼激光器自下而上檢測雙抗夾心復(fù)合物的拉曼信號強度實現(xiàn)高靈敏定量檢測。

在激光功率為200 mW，積分時間為2 s，1次時，分別檢測制備的Au、Au@4MBA及Au@4MBA@Ag的拉曼信號，其中4MBA的濃度為10mM，觀察其拉曼信號的強弱，從而選擇具有SERS效應(yīng)的納米粒子。如圖 2所示。Au NPs本身不具備拉曼信號，添加拉曼報告分子4MBA形成Au@4MBA時，拉曼信號也無明顯增強，但包裹銀殼在Au@4MBA外層形成核殼結(jié)構(gòu)Au@4MBA@Ag后拉曼信號顯著增強，為高靈敏度檢測提供了良好基礎(chǔ)。

因偶聯(lián)物的用量將會影響檢測的靈敏度，需要考察偶聯(lián)物的最佳配比，取 IL-6系列標(biāo)準(zhǔn)溶液0 pg/mL、10 pg/mL和500 pg/mL，各吸取100 μL于微型小孔中，分別加入3 μL Au@4MBA@Ag-15H5示蹤偶聯(lián)物及0.03，0.1，0.2，0.3，0.4 μL Biotin-19D6捕獲偶聯(lián)物于恒溫震蕩儀中孵育反應(yīng) 5 min，隨后加入 40 μL SA磁珠后繼續(xù)震蕩反應(yīng) 10 min，進行拉曼檢測。應(yīng)選擇既能滿足臨床檢測的靈敏度，又能在 IL-6質(zhì)量濃度范圍內(nèi)測得拉曼信號變化大，區(qū)別最明顯的反應(yīng)體系。 

如圖3所示，當(dāng)捕獲偶聯(lián)物用量為0.1 μL，拉曼信號在0 pg/mL和10 pg/mL之間有明顯的變化趨勢，滿足臨床靈敏度的檢測要求，同時，質(zhì)量濃度為500 pg/mL拉曼信號區(qū)別最明顯。故確定最佳體系為3 μL Au@4MBA@Ag-15H5 示蹤偶聯(lián)物和0.1 μL Biotin-19D6捕獲偶聯(lián)物。

利用建立的雙抗夾心磁免疫表面增強拉曼散射法分別對不同濃度的IL-6系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進行拉曼檢測并采集信號，得到的拉曼光譜如圖4a所示。IL-6的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-57404x2 + 184903x + 2408.4，r= 0.9997。圖4b表明，IL-6在0.0~1000.0 pg/mL范圍內(nèi)與拉曼信號響應(yīng)值具有良好的相關(guān)性。

分別使用本測定方法和臨床使用的化學(xué)發(fā)光法對 57 例臨床血清樣本進行測試對比。采用SPSS16.0軟件進行配對t檢驗和一元直線回歸分析，配對t檢驗結(jié)果t=0.985、P=0.329 >0.05，表明兩種方法無統(tǒng)計學(xué)差異，線性回歸方程為 y = 0.9757x + 5.9323，相關(guān)系數(shù) r=0.9896，P<0.01，結(jié)果如圖6所示，兩者相關(guān)性良好。因此，與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)使用的化學(xué)發(fā)光法相比，基于 SERS 在血清中定量檢測 IL-6 表現(xiàn)出令人滿意的性能。

利用研發(fā)的Portman 785nm便攜式拉曼光譜儀，并采用三明治夾心法原理的方法檢測血清中的白細胞介素-6的濃度，具有靈敏度更高、操作簡單、選擇性好、無需清洗以及檢測時間僅需15 min等優(yōu)點，不僅適用于血清中IL-6的高靈敏度定量檢測，也為膿毒癥生物標(biāo)志物的檢測提供新的技術(shù)參考，可以為日益嚴(yán)格的臨床檢測提供實踐參考，具有良好的應(yīng)用前景和實用價值。