反相GX液相色譜和質(zhì)譜（MS）的聯(lián)用為蛋白質(zhì)/多肽分析提供了強大的工具。
20世紀(jì)80年代，約翰·貝內(nèi)特·芬恩和他的同事們開發(fā)了電噴霧離子源，使質(zhì)譜與反相GX液相色譜得以聯(lián)用。
采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的好處包括：

• 質(zhì)譜是非常靈敏的檢測技術(shù)。

• 質(zhì)譜可以提供所分離多肽/蛋白質(zhì)的分子量。

• 質(zhì)譜可利用分子量特異性檢測蛋白質(zhì)。

• 片段信息有助于確認(rèn)多肽。

• 質(zhì)譜基于電荷和質(zhì)量進行分離和測定，因此，與基于疏水性分離的反相色譜“正交”。

GX液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用廣泛用于肽圖的分析，提供了一種正交檢測肽法（參考文獻15）。
如圖26所示，總離子質(zhì)量色譜圖與紫外色譜圖相似，但由于正交檢測的使用，峰的大小不同。
事實上，采用紫外檢測出現(xiàn)的小峰在質(zhì)譜圖中會更明顯（見圖26“*”）。

圖26. 肽圖的分離可以通過紫外檢測和質(zhì)譜檢測來監(jiān)測。
峰高是檢測法的一個函數(shù)，在紫外圖譜和質(zhì)譜圖譜間有明顯不同。
特別是用“*”標(biāo)示的肽對。它們在UV檢測圖譜中顯示的峰值較小，但在質(zhì)譜圖中峰值較大。

通過測定每個峰中肽的分子量，質(zhì)譜分析法為識別RP-HPLC法分離的峰提供了有用的信息。
由于質(zhì)譜與反相GX液相色譜正交，因此質(zhì)譜還能確定峰純度或顯示兩種或兩種以上肽的共洗脫，并能提供肽的分子量。
圖27以肽圖中的三個峰值展示了這一點。A峰較早洗脫出來，是分子量為439道爾頓的四肽。B峰是一種糖肽，有寡糖或多聚糖吸附。
通過質(zhì)譜圖中B峰存在質(zhì)荷比為204和366兩種離子確定，這表明存在糖基化反應(yīng)。
C峰是一種二硫化物連接的二肽——由二硫鍵連接的兩個多肽。
顯示該肽有四種離子形式：+1、+2、+3和+4。只有含兩個氨基末端和兩個堿性氨基酸的二肽才會出現(xiàn)+4離子。

圖27. 反相色譜強大的分離能力與第二個維度的質(zhì)譜的結(jié)合為肽圖提供了大量的信息。

A. MS確認(rèn)A峰代表小分子肽。

B. 檢測到的B峰代表含多聚糖（糖）的肽。

C. C峰代表一種二肽——由二硫鍵連接的兩個肽。

HPLC-MS

聯(lián)用的兩個重要因素是電噴射接口的**流速及三氟乙酸對肽電離的影響

基本電噴霧接口的信號在5~10μL/min的流速區(qū)間上迅速下降（圖28）。
這與采用標(biāo)準(zhǔn)分析型HPLC柱的流速不相容。
目前，商用電噴霧提供一種高剪切流氮氣輔助的電噴霧（氣流輔助電噴霧），它將電噴霧的**流速區(qū)間提升到了200~500μL/min。
這仍然低于標(biāo)準(zhǔn)分析柱通常所用的**流速，因此，目前科學(xué)家在使用HPLC-MS時，普遍采用流速為200~300μL/min的細(xì)孔柱（內(nèi)徑~2 mm）

圖28. 紅線表示基本電噴霧接口流速與信號響應(yīng)的關(guān)系。藍線同樣表示氣流輔助電噴霧的信號響應(yīng)。

如圖29所示，流動相中的TFA流入電噴霧接口導(dǎo)致蛋白質(zhì)和多肽的信號減弱。
這是由于TFA和多肽間強烈的相互作用將多肽中和。

圖29. 使用電噴霧接口時，TFA的流入會大幅減弱多肽的信號。

有兩種方法可糾正由TFA引起的信號減弱：

• 忽略信號損失。通常，當(dāng)信號足夠強大時，即使信號減弱也仍能獲得有用的數(shù)據(jù)。在這種情況下可以忽略信號損失。

• 當(dāng)信號損失過多時，**的解決方案是將高純度硅膠柱與低濃度TFA結(jié)合使用。
  高純度硅膠柱與低濃度TFA一同使用仍能維持較好的峰形（圖30）。
  采用高純度硅膠柱能得到良好的信號響應(yīng)和峰形。

其它方案包括用甲酸代替TFA或柱后采用乙酸或丙酸代替TFA。
但采用甲酸得到的峰形不如TFA，分離度也不如TFA，因此會影響性能。
這在蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用中可以接受，但在蛋白質(zhì)ZL藥物中不可行。
柱后替換TFA較為棘手，且會導(dǎo)致分辨率下降。

圖30. 高純度硅膠與低濃度TFA一同使用，保持肽的峰形。

色譜柱：ACE 5 C18, 4.6 x 250 mm（高純度硅膠）

洗脫液：加入如圖所示的TFA，以10%-55%的乙腈（ACN）梯度洗脫，洗脫時間為37.5分鐘。