肽圖分析法 - 蛋白質(zhì)和多肽反相HPLC分析和純化指南

反相GX液相色譜已成為蛋白質(zhì)分析和表征的標(biāo)準(zhǔn)方法，尤其是ZL性藥物的分析和表征。
反相色譜分析法分辨率高，檢測(cè)靈敏度好，能夠提供大量關(guān)于蛋白質(zhì)的信息。
有些時(shí)候，蛋白質(zhì)作為完整的分子分析，但更多的時(shí)候采用蛋白水解酶作用于特殊的氨基酸殘基將碳骨架斷開，從而將蛋白質(zhì)裂解成小片段。
隨后用反相GX液相色譜法對(duì)裂解產(chǎn)生的肽段進(jìn)行分析。
該技術(shù)叫作肽圖分析，是一種標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)分析方法。
通過(guò)反相色譜分析蛋白質(zhì)裂解后的肽段能夠獲得蛋白質(zhì)的大量信息。
通過(guò)比較表達(dá)蛋白與參照標(biāo)準(zhǔn)蛋白的肽圖能夠得出蛋白純度和表達(dá)的準(zhǔn)確性。肽圖通常作為蛋白質(zhì)ZL藥物的鑒定分析工具。

• 通過(guò)肽圖可以確定蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物，如發(fā)生脫酰胺作用的天冬酰胺和氧化甲硫氨酸。

• 肽圖可以確認(rèn)或驗(yàn)證二硫鍵連接，以此得出蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)和LX。

• 肽圖能夠確定糖基化（加入碳水化合物）位點(diǎn)，為詳細(xì)鑒定連接在其上的寡糖提供了條件。

• 利用質(zhì)譜檢測(cè)得到的肽圖為蛋白質(zhì)鑒定、肽序列分析和數(shù)據(jù)確認(rèn)提供了一種先進(jìn)的手段。

在生物蛋白質(zhì)組研究中，蛋白酶水解產(chǎn)物還用于蛋白質(zhì)的鑒定和定量分析。

有許多蛋白水解酶都能斷開蛋白質(zhì)的碳骨架，通常作用于特殊氨基酸殘基。包括：

 胰蛋白酶是Z常用的蛋白水解酶（蛋白酶）。以下為胰蛋白酶水解蛋白的五個(gè)階段：（注：參考文獻(xiàn)21詳細(xì)回顧了胰蛋白酶的水解）

1. 變性。要在合理的時(shí)間內(nèi)完成蛋白質(zhì)水解，必須對(duì)蛋白質(zhì)作變性處理。高溫下（37℃），將蛋白質(zhì)置于6M 鹽酸胍或8M 尿素等離液劑中，在中性pH值（~7.5）緩沖液下處理30分鐘，蛋白質(zhì)即可變性。

2. 二硫鍵的還原。二硫鍵會(huì)阻止蛋白質(zhì)的完全變性。
   通常可通過(guò)在待水解蛋白的變性過(guò)程中加入濃度為~20 mM 的二硫蘇糖醇（DTT）等還原劑將二硫鍵還原。

3. 游離半胱氨酸的羧甲基化。如果還原性半胱氨酸保持游離狀態(tài)，則有可能以錯(cuò)誤的方式重新形成二硫鍵。
   為了避免這種情況，可加入濃度為~60mM的碘乙酸等試劑，在37℃溫度下處理30分鐘，使游離半胱氨酸甲基化。該反應(yīng)由100 mM DTT 退火。

4. 脫鹽。當(dāng)溶液中存在尿素或胍鹽時(shí)，水解反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行，因?yàn)橐鹊鞍酌缸陨碜鳛橐环N蛋白質(zhì)會(huì)變性，失去酶活性。
   尿素或胍鹽必須通過(guò)離子交換或滲析去除或?qū)舛冉档椭?/span>1M以下。

5. 胰蛋白酶水解。脫鹽后，將蛋白質(zhì)溶解在pH7.5~8.5（胰蛋白酶的Z高活性pH）的緩沖液中——Tris或碳酸銨，并在20~100個(gè)待水解蛋白組分中加入一份胰蛋白酶，隨后在低溫至37℃的溫度區(qū)間內(nèi)處理蛋白質(zhì)。
   低溫處理時(shí)間長(zhǎng)達(dá)16個(gè)小時(shí)。在37℃下，水解可在1~4小時(shí)內(nèi)完成，具體取決于蛋白質(zhì)。
   如果胰蛋白酶的時(shí)間、溫度或相對(duì)濃度均過(guò)低，則水解將不完全，一些潛在裂解可能不發(fā)生，Z終導(dǎo)致形成含賴氨酸或精氨酸的大分子肽。
   如果胰蛋白酶的水解時(shí)間、溫度或濃度均過(guò)高，則會(huì)發(fā)生胰蛋白酶自身溶解，產(chǎn)生“自溶產(chǎn)物”，即胰蛋白酶水解產(chǎn)生的肽段，從而造成混淆。
   慣常的做法是忽略蛋白質(zhì)，考慮胰蛋白酶。按照蛋白質(zhì)完全水解的條件對(duì)得到的樣品進(jìn)行色譜分析，了解胰蛋白酶自溶的程度以及肽圖中任何胰蛋白酶自溶肽產(chǎn)物的位置。
   開發(fā)胰蛋白酶水解協(xié)議過(guò)程中，對(duì)胰蛋白酶和蛋白質(zhì)的水解時(shí)間、溫度和相對(duì)濃度進(jìn)行了優(yōu)化。
   當(dāng)利用肽圖確定二硫鍵的位置時(shí)，必須在不還原二硫鍵的情況下水解蛋白。但在二硫鍵未被還原的情況下，許多蛋白質(zhì)的水解速度非常慢。
   在缺還原劑的情況下，如果水解速度很慢或水解不佳，可利用Lys-C代替胰蛋白酶，并在4M尿素中水解，維持水解過(guò)程中蛋白質(zhì)的變性。
   水解過(guò)程中有時(shí)采用表面活性劑維持溶液中的蛋白質(zhì)，但表面活性劑會(huì)降低色譜分辨率，應(yīng)盡量避免。

胰蛋白酶水解分析。蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的肽段利用反相GX液相色譜分析，流動(dòng)相采用含TFA體系（參見第15-17頁(yè)），以起始濃度約5%的乙腈梯度洗脫（乙腈起始濃度低于5%可能導(dǎo)致較早洗脫出肽的色譜的不可重現(xiàn)性），乙腈濃度逐漸升至70%（參見圖31）。
梯度洗脫的時(shí)間取決于待水解蛋白的大小。
大分子蛋白比小分子蛋白水解產(chǎn)生更多的肽段，因此肽段的分離需要更長(zhǎng)洗脫時(shí)間。
小分子蛋白（小于20kd）水解產(chǎn)生的肽通?？稍?/span>45~60分鐘內(nèi)完成分離。
大分子蛋白（20-50kd）需要較長(zhǎng)的洗脫時(shí)間，一般為60~120分鐘。
分子量大于50kd的蛋白質(zhì)需要120~180分鐘的洗脫時(shí)間。
采用1~2 ml/min 的流速和適宜的溫度時(shí)分辨率**。
通常采用C18 反相柱?？梢允褂每讖綖?/span>100埃或300埃的柱子，其選擇性通常不同。

圖31. 牛血清白蛋白的肽圖

色譜柱：ACE 5 C18-300 寬孔柱，4.6 x 150 mm

流動(dòng)相：4%~70%乙腈-0.1% TFA 體系，混合梯度洗脫120分鐘。

 
蛋白質(zhì)修飾引起肽保留時(shí)間的變化。如果蛋白質(zhì)因翻譯或表達(dá)錯(cuò)誤，降解（脫酰胺作用、氧化反應(yīng)）或過(guò)程變異而改變，則這種改變將會(huì)反映在一種或多種肽段。
由于與肽的反相相互作用的靈敏度，肽的任何變化都將導(dǎo)致該肽保留時(shí)間的變化。
在圖32示例中，相差一個(gè)氨基酸的兩種十肽，其中一個(gè)為蘇氨酸，另一個(gè)為絲氨酸，在反相HPLC圖譜中出現(xiàn)了兩個(gè)峰。
不僅僅是一個(gè)氨基酸的差別，而且兩種氨基酸均為羥基氨基酸，它們的不同之處在于蘇氨酸側(cè)鏈上加了一個(gè)甲基。
這說(shuō)明了蛋白質(zhì)的任何變化都會(huì)反映為肽的變化，從而導(dǎo)致該肽保留時(shí)間的改變。
肽圖分析的本質(zhì)是反相HPLC能夠?qū)崿F(xiàn)差別細(xì)微的多肽的分離。

圖32. 以RP-HPLC對(duì)緊密關(guān)聯(lián)的肽類進(jìn)行分離。
僅有一個(gè)氨基酸不同的兩種十肽菌素，一種含絲氨酸，而另一種含蘇氨酸。

條件

色譜柱：C18 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米

洗脫液：

A. 含有0.1%三氟乙酸的水溶液

B. 含有0.08%三氟乙酸的乙腈溶液

梯度：0 - 35%的B溶液超過(guò)73分鐘

試樣肽圖與參照蛋白質(zhì)肽圖的比較。肽圖能夠提供有關(guān)蛋白質(zhì)的很多信息。
慣常做法是對(duì)試樣的肽圖和參照蛋白質(zhì)的肽圖進(jìn)行比較。
圖33對(duì)重組人生長(zhǎng)激素（在大腸桿菌中表達(dá)）的肽圖和天然人生長(zhǎng)激素（缺乏甲硫氨酸）的肽圖進(jìn)行了比較。
由于甲硫氨酸的疏水性質(zhì)，重組人生長(zhǎng)激素比天然人生長(zhǎng)激素較晚洗脫出來(lái)。
在這個(gè)例子中，為了便于比較，將第二幅圖譜倒置顯示。
在一些情況下，為了確認(rèn)微小的變化和證明分析工具與肽圖的變化無(wú)關(guān)，會(huì)將兩種水解產(chǎn)物混合進(jìn)行色譜分析。

肽圖比較揭示了蛋白質(zhì)的改變和修飾，如：基因改變、翻譯錯(cuò)誤、蛋白降解（脫酰胺作用、氧化反應(yīng)），以及翻譯后修飾的改變。

圖33. 重組人生長(zhǎng)激素和天然人生長(zhǎng)激素（缺乏甲硫氨酸）肽圖的比較。

條件：

色譜柱：C18寬孔柱，4.6 x 150 mm

流動(dòng)相：0~70% 乙腈-0.1% TFA 體系梯度洗脫