在微生物學實驗中,測定細菌培養(yǎng)液中的細胞濃度是一項常見的實驗。研究人員常透過測量OD600(600nm波長處的吸光值)(Optical Density at 600nm),來快速估算細菌濃度,進而了解細菌的生長曲線。一般來說,實驗室觀測細菌生長期時,多依靠對培養(yǎng)時間的經(jīng)驗和目測濁度來推斷。如果實驗需要使用特定生長階段的細菌,則通過分光光度計進行OD600測量,有助于準確判讀細菌細胞濃度和生長階段。本文將概述OD600測量的原理和應用,并介紹可用于快速進行 OD600 測定的EzDrop 1000C分光光度計。
OD是optical density的縮寫,代表光密度(或稱吸光值),而OD600則是指在600nm波長下測得的吸光值,常用于測量菌液濃度(cells/ml)。根據(jù)比爾-朗伯定律(Beer-Lambert law),吸光值與溶液中吸光物質(zhì)的濃度成正比。不過需要注意的是,這個定律僅適用于溶液中物質(zhì)「吸收」光線的情況,而細菌細胞濃度的OD600測量則是由于細菌細胞在懸浮液中「散射」光線所導致的。
在這樣的混濁樣品中,培養(yǎng)液中懸浮的微生物顆粒會散射光線,因此無法建立 OD600 測量值與細胞濃度之間的直接線性關系。OD600值實際上取決于微生物懸浮液中散射的光量。細菌細胞的大小、形狀和結構都會影響光的散射程度,進而導致OD值的變化。
此外,各家品牌的分光光度計所使用的光學系統(tǒng)元件不同,進而也會影響光的散射程度。因此,同一樣品在不同分光光度計上的OD600值可能會有所不同。為此,在使用該方法測量細菌濃度之前,強烈建議先利用序列稀釋后的特定細菌培養(yǎng)物建立一個標準的 OD600曲線,透過該曲線,可以準確地確認處于不同OD600值范圍內(nèi)的細胞濃度。同樣的方法也適用于酵母培養(yǎng)物濃度測量。
在實驗室中最常見的細菌培養(yǎng)物是大腸桿菌(E.coli)。當測量這類培養(yǎng)物在600nm波長處的吸光值時,所得到的數(shù)據(jù)可提供細胞生長的重要信息。例如,當OD600值介于0.6-0.8之間,表示細菌處于快速生長的對數(shù)生長期;當細菌培養(yǎng)物的OD600值超過0.8時,可能表示增殖已經(jīng)停止,需要將其轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)液中以維持正常的細胞生長。而當OD600值超過1時,代表細菌已達到飽和,可以準備進行轉(zhuǎn)代培養(yǎng)。
圖片來源:Jove:Growth Curves: Generating Growth Curves Using Colony Forming Units and Optical Density Measurements
使用EzDrop 1000C進行OD600測量
EzDrop 1000C 是一款專為測量DNA/RNA、蛋白質(zhì)以及微生物濃度而設計的分光光度計,具有比色管(Cuvette)和超微量(Drop)兩種模式。比色管模式可快速定量分析微量(1ml)生物樣品。建議使用固定光徑長度10 mm的石英玻璃比色管來盛裝樣品,可提供優(yōu)異的測量準確度并減少光散射,非常適合用于OD600測量。只需將樣品加入比色管并放入EzDrop 1000C分光光度計中,即可在幾秒鐘內(nèi)完成測量。
EzDrop 1000C超微量比色管分光光度計
EzDrop 1000C OD600 測量界面
EzDrop 1000C的比色管模式吸光值范圍為0.002-1.5,若樣品超過這個范圍僅需稀釋即可使用。儀器操作界面具有貼心功能,在測量前可先輸入細胞數(shù)量濃度系數(shù)(cell number concentration factor)(其預設值為1x108)及稀釋倍數(shù)(Dilution Factor),儀器可以直接顯示原菌液濃度(Recalculated [conc.])。
OD600 測量作為細菌濃度估算的常用方法,在微生物研究中具有重要意義。透過深入了解其原理、優(yōu)點和限制,以及適當?shù)臏y量方式和設備選擇,可以更有效地應用于實驗中。EzDrop 1000C是一款功能強大、操作簡便的分光光度計,能夠廣泛應用于微生物學實驗中對細菌細胞濃度的測量需求。
參考文獻
1. Apparent diameter and cell density of yeast strains with different ploidy
2. Why is 600nm wavelength recommended for optical density check of bacteria culture and is there any literature to back it?
3. Kamonnaree Chotinantakul, Wipa Suginta, and Albert Schulte.(2014) Advanced Amperometric Respiration Assay for Antimicrobial Susceptibility Testing.Analytical Chemistry.
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