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2026-03-26 11:25:45合成生物學
合成生物學是一門交叉學科，它結合生物學、工程學、計算機科學等多個領域，旨在通過設計、構建和改造生物系統(tǒng)，以創(chuàng)造新的生物功能、產品或過程。該領域的研究人員利用基因編輯、合成基因網絡等技術，模擬自然界的生物過程，甚至設計出全新的生物部件和系統(tǒng)。合成生物學的應用廣泛，包括生物制造、醫(yī)藥開發(fā)、環(huán)境治理等，為解決能源危機、環(huán)境污染等全球性問題提供了新思路。

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2023-04-10 15:50:43合成生物學握手AI，你想要的合成生物學
根據(jù)NCBI的ClinVar數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計，包括罕見疾病，如鐮狀細胞病、地中海貧血和先天性萊伯黑朦等超過3萬7千種已知疾病與致病性單核苷酸變異（SNV）有關，SNV可能導致原始DNA序列、轉錄水平和蛋白質序列等其他特性的變化。而新一代CRISPR/Cas9技術——堿基編輯器（BEs）可以有效地修復堿基突變，而不會誘導雙鏈DNA斷裂，從而能夠直接、不可逆地校正堿基突變，對于治愈SNV引起的遺傳疾病具有十分廣闊的前景。已經報道的有誘導C·G到T·A轉化的胞嘧啶堿基編輯器（CBE）、誘導A·T到G·C轉化的腺嘌呤堿基編輯器（ABE）和使C·G到G·C轉換的糖基化酶堿基編輯器（GBE），這些BEs為治 療50%以上致病性SNV提供了幾乎理想的解決方案。然而，在實施基于BE的基因療法之前，有必要大量構建具有致病性SNV的細胞疾病模型，以用于開發(fā)和優(yōu)化BEs，并使其在基因治 療中的應用成為可能。同時，根據(jù)ClinVar的數(shù)據(jù)，大約50%的人類致病性SNV是C·G到T·A的轉化，然而目前很難通過合理的人力和資金投入獲得大量攜帶這些SNV的細胞模型。這一方面是由于大規(guī)模樣品，手動操作不僅耗時，而且容易出錯，一致性較差且成本高昂；另外一方面，現(xiàn)有的基于目標-位點集成庫的方法，如Be-Hive等在為AI學習和預測編輯性能的數(shù)據(jù)時，缺乏原位信息的綜合編輯位點數(shù)據(jù)，同時又缺少真實染色體環(huán)境（先前研究表明，核酸酶的性能與染色質可及性之間存在很強的相關性，并且基因編輯在真核染色質中比異染色質中更有效）。中科院天津工業(yè)生物技術研究所和天津科技大學的團隊，開發(fā)了一個由以下四個模塊組成的用于哺乳動物細胞高通量原位基因編輯的自動化平臺，實現(xiàn)了哺乳動物細胞基因編輯的標準化和可拓展性。（1）內源性靶gRNA計算機輔助設計；（2）gRNA表達質粒構建；（3）哺乳動物細胞堿基編輯；（4）CBEs性能模型構建的機器學習。四個模塊組成的用于哺乳動物細胞高通量原位基因編輯的自動化平臺，實現(xiàn)了哺乳動物細胞基因編輯的標準化和可拓展性。該平臺借助大規(guī)模的原位編輯數(shù)據(jù)和序列信息，結合局部染色質可及性，具有原位數(shù)據(jù)的機器學習模型能夠更好地預測實際的堿基編輯效率，使獲得內生目標的大規(guī)模編輯數(shù)據(jù)集成為可能。圖1 全自動高通量哺乳動物基因編輯平臺概覽在這四個模塊中，第 一個模塊用于負責gRNA設計，以將人類致病性SNV引入野生型細胞，作者使用生物信息學分析選擇了1210個基因作為靶位點，使用包含每個靶位點上游3 bp至下游750 bp靶區(qū)的DNA序列，分批處理用于分析編輯結果的三對引物。對于自動化gRNA質粒構建工作流程模塊，gRNAs質粒構建過程中采用了貝克曼庫爾特Echo納升級聲波移液系統(tǒng)用于操縱DNA組裝反應，相對于標準的Golden Gate DNA組裝方法的反應體積為15μl，Echo的納升級和無吸頭操作能夠對實驗步驟進行一系列優(yōu)化，將反應系統(tǒng)最小化到1微升的總體積，從而顯著降低了實驗成本。隨后使用貝克曼庫爾特Biomek i7自動化移液工作站將DH5α感受態(tài)細胞與Golden Gate產物進行混合，通過ClonePix進行轉化鋪板，并在通過DNA測序驗證構建質粒之后，使用Biomek i7進行質粒提取。為了分析數(shù)據(jù)編輯結果，使用Python腳本讀取sanger測序文件，比較N20，并創(chuàng)建兩個參考csv文件。錯誤的組裝csv文件包括一個選擇列表，用于從48孔細菌菌落板到96孔深孔板中挑選新菌落，以便ClonePix進行另一輪驗證。正確組裝csv文件包含N20測序及其在96孔深孔板中的位置，用于使用貝克曼庫爾特Biomek i7自動化移液工作站進行質粒提取。此模塊高通量自動化系統(tǒng)在4天之內共構建和分析了1210個gRNA質粒，成功率達99%，實現(xiàn)了每天384個gRNA組裝的通量。而后續(xù)使用Biomek i7進行的質粒提取，通量則可達到576個質粒/天。圖2 全自動gRNA質粒構建工作流程概述示意圖第三個模塊是哺乳動物細胞中的堿基編輯，如圖3。通過優(yōu)化實驗條件，作者開發(fā)了使用Biomek i7自動化移液工作站進行包括細胞接種和轉染、細胞培養(yǎng)基更換以及進行樣品收集在內的編輯過程。隨后進行靶區(qū)域的細胞裂解和PCR擴增。全自動高通量系統(tǒng)在6h內將1210組gRNA和BE4max質粒共轉染到HEK293T細胞中，并在2 h內完成后續(xù)培養(yǎng)基更換。培養(yǎng)5天后，收獲編輯的細胞于8小時內完成進行PCR分析，然后進行sanger測序。使用Python腳本產生3個csv文件，一個用于準備新一輪PCR的挑選列表，以分析使用Biomek i7從96孔裂解樣品板到96孔PCR板的false sample；第二個csv文件包含用于分析false sample的第二個引物對的序列和位置信息，用于新一輪PCR；第三個csv文件包含正確的樣本和編輯效率結果，用于下一步的AI學習。圖3 自動化基因編輯過程的工作流程概述第四個模塊為作者開發(fā)的AI模型——染色質可及性學習模型（CAELM），預測基礎編輯的結果。CAELM基于自動化平臺生成的高度均勻的原位基因組編輯數(shù)據(jù)，預測HEK4T細胞中的BE293max行為，并實現(xiàn)了0.64的皮爾遜相關值。皮爾遜r是評估數(shù)值數(shù)據(jù)模型準確性的最普遍指標之一，CAELM模型中考慮了目標序列的真實染色體環(huán)境，這提供了更好、更現(xiàn)實的預測；同時，CAELM還提供了模型輸入的特征重要性得分，并揭示了DNA可及性相對于目標序列上下文的貢獻在預測中接近1:6。通過與32個不同基因組位點的手動操作進行比較，其中16個目標位點在兩個操作過程中的編輯效率幾乎相等，而自動化高通量系統(tǒng)在其他14個位點的統(tǒng)計分析中表現(xiàn)出更高的編輯效率。這些結果表明，自動化高通量系統(tǒng)能夠以與手動操作相當?shù)男蕡?zhí)行基礎編輯；隨機選擇BE4max編輯靶標的1210個與疾病相關的SNV的編輯效率均達到了較高水平，說明可以同時有效地操縱數(shù)千個內源性靶位點的人類細胞的全自動高通量原位基因編輯平臺的成功建立。
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2022-11-25 17:36:55大咖共話｜合成生物學工藝探討與在線過程分析展望
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2025-05-20 20:40:56GelMA合成步驟
打擾大家了，想咨詢一下GelMA合成過程使用A型明膠還是B型明膠呀？
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2023-02-15 14:27:47腫瘤疫苗生物學活性評估
腫瘤疫苗背景腫瘤疫苗，是一種具有預防和治 療潛力的有吸引力的替代免疫治 療選擇，是近年研究的熱點之一。針對腫瘤相關抗原（Tumor-associated antigen,TAA）或腫瘤特異性抗原 (Tumor specific antigen,TSA) 的疫苗可以特異性地攻擊和破壞抗原過表達的惡性細胞，并由于免疫記憶而實現(xiàn)慢性治 療反應。因此，與其他免疫療法相比，癌癥疫苗提供了特異性、安全性和可耐受的治 療。根據(jù)腫瘤抗原的組分，癌癥疫苗大致可以分為四種類型：基于 DNA 的疫苗，基于 RNA 的疫苗，基于多肽的疫苗和基于免疫細胞的疫苗。FDA 批準的首 個個性化腫瘤疫苗 PROVENGE (Sipuleucel-T) 是一種基于免疫細胞的疫苗，用于激素難治性前列腺癌的治 療。除此之外，Moderna，BioNTech 都在布局基于 mRNA 的腫瘤疫苗。圖 1 腫瘤疫苗抗原呈遞平臺示意圖腫瘤疫苗有效性評估方法生物體接種疫苗后，腫瘤抗原被帶到淋巴結，進而激活抗原特異性的 B 細胞和 T 細胞，活化的 B 細胞產生的抗體及活化的效應 T 細胞會使腫瘤內脹并誘導腫瘤細胞死亡。圖 2 腫瘤疫苗誘導的免疫反應示意圖如何有效的評估腫瘤疫苗的有效性是一個非常值得探討的問題，常用的腫瘤疫苗有效性驗證的方法，包括細胞因子檢測、CTL 活性檢測、T 細胞活化標志物檢測、抗體滴度檢測、ADCC 檢測等。1、細胞因子檢測細胞因子是由免疫細胞經過刺激而合成并分泌的小分子蛋白質，在免疫應答中起著非常重要的作用，因此可以通過細胞因子的分泌能力來反應疫苗誘導的細胞免疫的水平。常見的細胞因子有白介素 (IL) 、干擾素 (IFN)、 腫瘤壞死因子 (TNF) 等。下面比較了幾種常見的檢測方法。ELISA 是一種非常經典的細胞因子的檢測方法，例如在王曉東等人發(fā)表的關于胃癌疫苗研究的文章中，提到了用 ELISA 的方法檢測接種疫苗后小鼠骨 髓源樹突狀細胞（BMDCs）分泌細胞因子的能力，檢測方法如下：BMDCs 在含有 10ng/mL GM-CSF 和 10ng/mL IL-4 的 X-vivo 15 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃下培養(yǎng) 6 天，然后以每孔 5×104 細胞的密度在 96 孔板中接種。以 5μM 或 10μM 的最 終濃度加入疫苗抗原，孵育 24 小時。使用小鼠 TNF-α 和 IL-12 p70 ELISA Ready-SET-Go 試劑組定量培養(yǎng)上清中的 TNF-α 和 IL-12 。首先在 4℃下用捕獲抗體包被 ELISA 板過夜，然后在室溫下依次加入阻斷液、細胞培養(yǎng)上清和檢測抗體，孵育 1h 。 最 后加入終止液和顯色劑，用酶標儀 (BioTek) 在 450nm 處記錄 OD 值。檢測結果如下：從檢測結果可以看出，T7（TLR7 激動劑）的存在可以顯著提升 ML/MB 抗原誘導的免疫反應。圖 3 ELISA 法測定小鼠骨 髓樹突狀細胞 (BMDCs) 分泌TNF-α (a) 和 IL-12 (b) 的水平Ankita Leekha 等人發(fā)表的關于 SRAS-COV2 疫苗文章中，提到了用 ELISPOT 的方法評估細胞因子的分泌水平，可以作為參考。具體方法如下：從小鼠中分離脾細胞和肺細胞，使用小鼠 IFNγ ELISpot 基礎試劑盒和小鼠 IL4 ELISpot 基礎試劑盒 (Mabtech, VA, USA) 進行 IFNγ 和 IL4 ELISpot 檢測。在 37℃ 下，在預包被抗體的 ELISpot 板中，用抗原刺激脾細胞和肺細胞，培養(yǎng) 16-18 小時。第二天，洗掉細胞，加入生物素化的檢測抗體。洗板后，加入 1:30000 稀釋的 Extravidi-ALP 偶聯(lián)物，室溫孵育 1 小時。洗板后，每孔添加 70μL 顯色液，孵育 20-30min，形成斑點，然后用水清洗，干燥。使用 Cytation 7 (BioTek) 對斑點進行量化。每個點對應一個單獨的細胞因子分泌細胞。檢測結果如下：圖 4 ELIPSOT 方法檢測小鼠脾細胞和肺細胞分泌細胞因子的水平2、CTL 活性檢測疫苗誘導的細胞毒性 T 淋巴細胞 (CTL) 可以直接殺傷腫瘤細胞，起到抗腫瘤的作用，因此可以通過檢測 CTL 的殺傷效應來反應疫苗的效果。常用的檢測細殺傷效應的方法有很多，下表列舉了一些常用的方法。王曉東等人發(fā)表的文章中提到了 LDH 檢測，檢測方法如下：從接種疫苗小鼠的脾 臟中分離淋巴細胞（效應細胞）。EAC 腫瘤細胞（靶細胞）與淋巴細胞（效應細胞-靶細胞比例為 50:1）共培養(yǎng) 4h，使用乳酸脫氫 (LDH) 法測定細胞毒性。將培養(yǎng) 4h 后的培養(yǎng)上清加入在 ELISA 板中，室溫下加入底物溶液，孵育 30min。最 后，加入終止液終止反應，并用酶標儀 (BioTek) 在 490nm 處檢測光密度。檢測結果如下：相對于 PBS 對照組來說，T7-MB 組 CTL 細胞具有顯著的殺傷效應。圖 5 LDH 法測定 CTL 介導的 EAC 靶細胞的裂解水平3、抗體滴度及親和力檢測腫瘤疫苗除了可以誘導細胞免疫之外，也可誘導體液免疫，對此可通過對抗體滴度及親和力進行檢測來反應疫苗抗腫瘤的效果，ELISA 是一種非常經典的檢測方法。上述關于胃癌疫苗的文章中通過 ELISA 方法測定小鼠接種疫苗后血清中總 IgG 含量，具體檢測過程如下：小鼠接種疫苗后收集血液樣本，通過 3000g 離心 15 分鐘獲得血清樣本。ELISA 板預先在 4℃ 包被 BSA-MG1 過夜，然后在室溫下依次加載封閉溶液 2h，血清樣品 (1:50 稀釋) 和檢測抗體 1h。最 后，在體系中加入 p-NPP 底物 (Millipore) 和終止液，用酶標儀 (BioTek) 在 405nm 處記錄 OD 值。檢測結果如下：相對于 PBS 對照組來說，T7-MB 組抗體含量明顯上升。圖6 ELISA法測定疫苗誘導的血清抗體水平除此之外，在 Emily C. Gale 等人發(fā)表的關于 mRNA 遞送系統(tǒng)及輔劑研究的文章中，通過 ELISA 的方法測定了 mRNA OVA 模式疫苗誘導的 OVA 特異性抗體的絕 對含量及其親和力。具體檢測方法如下：抗體濃度：小鼠接種加強疫苗后，采集血液樣品，血清按照 1:100 000 進行稀釋。采用 anti-OVA mouse IgG1 ELISA (Cayman Chemicals) 試劑，按照試劑廠家的說明進行 ELISA 實驗。使用 Synergy H1 Microplate Reader (BioTek) 在 450nm 處記錄 OD 值。根據(jù)標準曲線計算血清抗體濃度，表示 mg/mL?？贵w親和性：將 12 個梯度稀釋的血清與恒定濃度標記 HRP 的 anti-OVA 抗體 (3nM) 混合，并在 OVA 抗原包被的板中室溫孵育 2 小時，洗板后用 TMB 底物孵育，用 HCl 停止反應。測定 450nm 處的 OD 值。根據(jù)業(yè)內發(fā)現(xiàn)的單克隆抗體的共同親和力，假設對照抗體的 KD 為 1nM 對實驗組的 KD 值進行統(tǒng)計。這一假設僅影響報告的絕 對 KD 值，而不影響實驗組之間的相對差異。檢測結果如下：pIC 為雙鏈 RNA 結構模擬物，圖E中比較了可溶性的 pIC 和不同納米顆粒遞送系統(tǒng)誘導的絕 對抗體含量，從圖 E 中可以看出 2B 遞送系統(tǒng)誘導的 OVA 特異性抗體含量最 高。從F和G可以看出 2B 遞送系統(tǒng)相對于可溶性 pIC 來說誘導的 IgG 親和力也顯著升高。圖 7 pIC/PBAE NPs 增強體液免疫4、ADCC 檢測疫苗誘導體液免疫產生的抗體能夠捕捉目標抗原，阻斷這個靶分子的功能，也可以引導其他免疫細胞（如巨噬細胞和自然殺傷細胞）殺死表達抗原的靶細胞，在腫瘤治 療中，特別是血液腫瘤中，抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用 (ADCC) 起著關鍵作用，ADCC 常用的檢測方法包括細胞活力檢測、LDH 檢測、工程細胞株、Delfia、RTCA、細胞成像檢測等。王曉東等人發(fā)表的關于胃癌疫苗研究的文章中，提到了 LDH 方法檢測 ADCC，檢測方法如下：小鼠接種疫苗后，采集其血清樣本（1:25 稀釋），然后與 EAC 細胞（靶細胞）在 37°C 孵育 30min。使用小鼠 NK 細胞分離試劑盒從正常 BALB/c 小鼠中分離出自然殺傷 (NK) 細胞（效應細胞），與抗體標記的 EAC 細胞以效靶比 50:1 共培養(yǎng) 4 小時。采用 LDH 法 (Promega) 測定細胞毒性，檢測方法與之前提到的 CTL 活性檢測的方法一致。檢測結果如下：相對于 PBS 對照組來說，T7-MB 組產生的抗體具有顯著的殺傷效應。圖 8 LDH 法測定血清抗體介導的 EAC 靶細胞的裂解水平腫瘤疫苗生物學活性檢測解決方案推薦本文介紹了腫瘤疫苗活性檢測的常用方法，包括細胞因子檢測、CTL 活性檢測、抗體滴度及親和力檢測、ADCC 檢測等方法，涉及到了酶標儀、成像系統(tǒng)、流式、RTCA、洗板分液系統(tǒng)等設備。Agilent 細胞分析事業(yè)部可以從多個角度為用戶提供從樣品處理，到結果檢測再到數(shù)據(jù)分析的全面解決方案。
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2025-01-17 12:00:15dna合成儀生產商未來發(fā)展如何？
DNA合成儀生產商：創(chuàng)新與科技引領基因合成的未來 在生物技術的飛速發(fā)展中，DNA合成儀作為關鍵設備之一，已成為現(xiàn)代科研和生物醫(yī)藥行業(yè)的重要工具。隨著基因編輯、基因以及個性化醫(yī)療的崛起，DNA合成儀的市場需求日益增加。本文將深入探討DNA合成儀生產商的市場現(xiàn)狀、技術創(chuàng)新及其對科學研究和產業(yè)應用的深遠影響，幫助讀者了解DNA合成儀產業(yè)的未來趨勢及其潛力。 1. DNA合成儀的市場前景 DNA合成儀，顧名思義，是一種能夠根據(jù)預設的序列合成特定DNA分子的設備。這類儀器廣泛應用于基因工程、制藥行業(yè)、癌癥研究以及疫苗開發(fā)等多個領域。隨著基因合成技術的不斷進步，DNA合成儀的性能也在不斷提升，包括提高合成速度、準確性和成本效益，使得科學家能夠更快速、更高效地進行基因合成及實驗研究。 目前，DNA合成儀的需求不僅僅局限于學術研究機構，越來越多的生物技術公司、制藥企業(yè)和診斷公司也開始引入這一技術。這種趨勢促使DNA合成儀生產商不斷推陳出新，滿足日益復雜的市場需求。 2. DNA合成儀生產商的技術創(chuàng)新 DNA合成儀生產商在設備的設計和技術創(chuàng)新方面已經取得了顯著進展。傳統(tǒng)的DNA合成方法存在一定的時間和成本限制，然而現(xiàn)代DNA合成儀利用自動化技術，大大提升了合成效率和精度。例如，采用光學檢測技術、固相合成法等新興技術，能夠在合成過程中實時監(jiān)控反應進程，確保高質量的DNA產物。 一些領先的DNA合成儀生產商也在努力降低設備的使用成本，提升小批量合成能力。這對于企業(yè)和科研機構來說是極具吸引力的優(yōu)勢，尤其是在面對基因編輯和個性化醫(yī)療領域的快速發(fā)展時，靈活的合成能力成為了行業(yè)發(fā)展的關鍵。 3. 領先的DNA合成儀生產商 目前，有多家知名的DNA合成儀生產商在該領域占據(jù)了領導地位。著名的公司如Thermo Fisher Scientific、Agilent Technologies和BioAutomation等，憑借其強大的研發(fā)能力和技術積累，已成為行業(yè)中的佼佼者。這些公司不僅在設備制造上不斷突破，且通過提供定制化的DNA合成解決方案，滿足不同用戶的需求，推動了整個行業(yè)的技術進步。 隨著中國在生命科學領域的崛起，一些本土DNA合成儀生產商也逐漸走向國際市場，憑借較為合理的價格和不斷創(chuàng)新的技術，受到了科研和生物技術公司的青睞。 4. DNA合成儀的應用前景 隨著個性化醫(yī)療和基因編輯技術的不斷發(fā)展，DNA合成儀的應用前景非常廣闊。在基因領域，能夠精確合成所需DNA序列的技術使得基因修復、基因替代以及基因免疫等方案成為可能。與此DNA合成儀還在生物制藥領域中扮演著重要角色，幫助開發(fā)新的藥物和疫苗。 5. 結論 總體而言，DNA合成儀作為現(xiàn)代生物技術的核心設備之一，正在不斷推動著生命科學領域的創(chuàng)新與突破。從科研到產業(yè)應用，DNA合成儀生產商正在不斷通過技術革新滿足不同市場需求。隨著基因合成技術的進一步發(fā)展，未來DNA合成儀的市場前景將更加廣闊，為生命科學研究和生物醫(yī)藥行業(yè)提供更加精確、高效和便捷的工具。 通過深入分析DNA合成儀的技術發(fā)展及應用前景，可以看出，這一領域將繼續(xù)迎來新一輪的技術創(chuàng)新和市場擴展。
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