根據(jù)NCBI的ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)，包括罕見疾病，如鐮狀細(xì)胞病、地中海貧血和先天性萊伯黑朦等超過3萬7千種已知疾病與致病性單核苷酸變異（SNV）有關(guān)，SNV可能導(dǎo)致原始DNA序列、轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)序列等其他特性的變化。而新一代CRISPR/Cas9技術(shù)——堿基編輯器（BEs）可以有效地修復(fù)堿基突變，而不會(huì)誘導(dǎo)雙鏈DNA斷裂，從而能夠直接、不可逆地校正堿基突變，對(duì)于治愈SNV引起的遺傳疾病具有十分廣闊的前景。已經(jīng)報(bào)道的有誘導(dǎo)C·G到T·A轉(zhuǎn)化的胞嘧啶堿基編輯器（CBE）、誘導(dǎo)A·T到G·C轉(zhuǎn)化的腺嘌呤堿基編輯器（ABE）和使C·G到G·C轉(zhuǎn)換的糖基化酶堿基編輯器（GBE），這些BEs為治 療50%以上致病性SNV提供了幾乎理想的解決方案。

然而，在實(shí)施基于BE的基因療法之前，有必要大量構(gòu)建具有致病性SNV的細(xì)胞疾病模型，以用于開發(fā)和優(yōu)化BEs，并使其在基因治 療中的應(yīng)用成為可能。同時(shí)，根據(jù)ClinVar的數(shù)據(jù)，大約50%的人類致病性SNV是C·G到T·A的轉(zhuǎn)化，然而目前很難通過合理的人力和資金投入獲得大量攜帶這些SNV的細(xì)胞模型。這一方面是由于大規(guī)模樣品，手動(dòng)操作不僅耗時(shí)，而且容易出錯(cuò)，一致性較差且成本高昂；另外一方面，現(xiàn)有的基于目標(biāo)-位點(diǎn)集成庫(kù)的方法，如Be-Hive等在為AI學(xué)習(xí)和預(yù)測(cè)編輯性能的數(shù)據(jù)時(shí)，缺乏原位信息的綜合編輯位點(diǎn)數(shù)據(jù)，同時(shí)又缺少真實(shí)染色體環(huán)境（先前研究表明，核酸酶的性能與染色質(zhì)可及性之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性，并且基因編輯在真核染色質(zhì)中比異染色質(zhì)中更有效）。

中科院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所和天津科技大學(xué)的團(tuán)隊(duì)，開發(fā)了一個(gè)由以下四個(gè)模塊組成的用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞高通量原位基因編輯的自動(dòng)化平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因編輯的標(biāo)準(zhǔn)化和可拓展性。

（1）內(nèi)源性靶g(shù)RNA計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)；

（2）gRNA表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建；

（3）哺乳動(dòng)物細(xì)胞堿基編輯；

（4）CBEs性能模型構(gòu)建的機(jī)器學(xué)習(xí)。

四個(gè)模塊組成的用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞高通量原位基因編輯的自動(dòng)化平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因編輯的標(biāo)準(zhǔn)化和可拓展性。該平臺(tái)借助大規(guī)模的原位編輯數(shù)據(jù)和序列信息，結(jié)合局部染色質(zhì)可及性，具有原位數(shù)據(jù)的機(jī)器學(xué)習(xí)模型能夠更好地預(yù)測(cè)實(shí)際的堿基編輯效率，使獲得內(nèi)生目標(biāo)的大規(guī)模編輯數(shù)據(jù)集成為可能。

圖1 全自動(dòng)高通量哺乳動(dòng)物基因編輯平臺(tái)概覽

在這四個(gè)模塊中，第 一個(gè)模塊用于負(fù)責(zé)gRNA設(shè)計(jì)，以將人類致病性SNV引入野生型細(xì)胞，作者使用生物信息學(xué)分析選擇了1210個(gè)基因作為靶位點(diǎn)，使用包含每個(gè)靶位點(diǎn)上游3 bp至下游750 bp靶區(qū)的DNA序列，分批處理用于分析編輯結(jié)果的三對(duì)引物。對(duì)于自動(dòng)化gRNA質(zhì)粒構(gòu)建工作流程模塊，gRNAs質(zhì)粒構(gòu)建過程中采用了貝克曼庫(kù)爾特Echo納升級(jí)聲波移液系統(tǒng)用于操縱DNA組裝反應(yīng)，相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)的Golden Gate DNA組裝方法的反應(yīng)體積為15μl，Echo的納升級(jí)和無吸頭操作能夠?qū)?shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行一系列優(yōu)化，將反應(yīng)系統(tǒng)最小化到1微升的總體積，從而顯著降低了實(shí)驗(yàn)成本。

隨后使用貝克曼庫(kù)爾特Biomek i7自動(dòng)化移液工作站將DH5α感受態(tài)細(xì)胞與Golden Gate產(chǎn)物進(jìn)行混合，通過ClonePix進(jìn)行轉(zhuǎn)化鋪板，并在通過DNA測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建質(zhì)粒之后，使用Biomek i7進(jìn)行質(zhì)粒提取。為了分析數(shù)據(jù)編輯結(jié)果，使用Python腳本讀取sanger測(cè)序文件，比較N20，并創(chuàng)建兩個(gè)參考csv文件。錯(cuò)誤的組裝csv文件包括一個(gè)選擇列表，用于從48孔細(xì)菌菌落板到96孔深孔板中挑選新菌落，以便ClonePix進(jìn)行另一輪驗(yàn)證。正確組裝csv文件包含N20測(cè)序及其在96孔深孔板中的位置，用于使用貝克曼庫(kù)爾特Biomek i7自動(dòng)化移液工作站進(jìn)行質(zhì)粒提取。此模塊高通量自動(dòng)化系統(tǒng)在4天之內(nèi)共構(gòu)建和分析了1210個(gè)gRNA質(zhì)粒，成功率達(dá)99%，實(shí)現(xiàn)了每天384個(gè)gRNA組裝的通量。而后續(xù)使用Biomek i7進(jìn)行的質(zhì)粒提取，通量則可達(dá)到576個(gè)質(zhì)粒/天。

圖2 全自動(dòng)gRNA質(zhì)粒構(gòu)建工作流程概述示意圖

第三個(gè)模塊是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的堿基編輯，如圖3。通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，作者開發(fā)了使用Biomek i7自動(dòng)化移液工作站進(jìn)行包括細(xì)胞接種和轉(zhuǎn)染、細(xì)胞培養(yǎng)基更換以及進(jìn)行樣品收集在內(nèi)的編輯過程。隨后進(jìn)行靶區(qū)域的細(xì)胞裂解和PCR擴(kuò)增。全自動(dòng)高通量系統(tǒng)在6h內(nèi)將1210組gRNA和BE4max質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，并在2 h內(nèi)完成后續(xù)培養(yǎng)基更換。培養(yǎng)5天后，收獲編輯的細(xì)胞于8小時(shí)內(nèi)完成進(jìn)行PCR分析，然后進(jìn)行sanger測(cè)序。使用Python腳本產(chǎn)生3個(gè)csv文件，一個(gè)用于準(zhǔn)備新一輪PCR的挑選列表，以分析使用Biomek i7從96孔裂解樣品板到96孔PCR板的false sample；第二個(gè)csv文件包含用于分析false sample的第二個(gè)引物對(duì)的序列和位置信息，用于新一輪PCR；第三個(gè)csv文件包含正確的樣本和編輯效率結(jié)果，用于下一步的AI學(xué)習(xí)。

圖3 自動(dòng)化基因編輯過程的工作流程概述

第四個(gè)模塊為作者開發(fā)的AI模型——染色質(zhì)可及性學(xué)習(xí)模型（CAELM），預(yù)測(cè)基礎(chǔ)編輯的結(jié)果。CAELM基于自動(dòng)化平臺(tái)生成的高度均勻的原位基因組編輯數(shù)據(jù)，預(yù)測(cè)HEK4T細(xì)胞中的BE293max行為，并實(shí)現(xiàn)了0.64的皮爾遜相關(guān)值。皮爾遜r是評(píng)估數(shù)值數(shù)據(jù)模型準(zhǔn)確性的最普遍指標(biāo)之一，CAELM模型中考慮了目標(biāo)序列的真實(shí)染色體環(huán)境，這提供了更好、更現(xiàn)實(shí)的預(yù)測(cè)；同時(shí)，CAELM還提供了模型輸入的特征重要性得分，并揭示了DNA可及性相對(duì)于目標(biāo)序列上下文的貢獻(xiàn)在預(yù)測(cè)中接近1:6。

通過與32個(gè)不同基因組位點(diǎn)的手動(dòng)操作進(jìn)行比較，其中16個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)在兩個(gè)操作過程中的編輯效率幾乎相等，而自動(dòng)化高通量系統(tǒng)在其他14個(gè)位點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)分析中表現(xiàn)出更高的編輯效率。這些結(jié)果表明，自動(dòng)化高通量系統(tǒng)能夠以與手動(dòng)操作相當(dāng)?shù)男蕡?zhí)行基礎(chǔ)編輯；隨機(jī)選擇BE4max編輯靶標(biāo)的1210個(gè)與疾病相關(guān)的SNV的編輯效率均達(dá)到了較高水平，說明可以同時(shí)有效地操縱數(shù)千個(gè)內(nèi)源性靶位點(diǎn)的人類細(xì)胞的全自動(dòng)高通量原位基因編輯平臺(tái)的成功建立。

● 機(jī)械生物學(xué)細(xì)胞反應(yīng)

   允許對(duì)受限制的細(xì)胞進(jìn)行高級(jí)分子和形態(tài)分析

● 精確的機(jī)械刺激

   通過實(shí)時(shí)調(diào)整限制來觸發(fā)機(jī)械刺激

● 標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)板

   兼容35 mm培養(yǎng)皿和平面

● 易于使用

   通過即插即用方式快速進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)置

機(jī)械生物學(xué)套裝包含壓力控制器和細(xì)胞限制器，以更好地模擬體內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)條件。Elveflow的Cobalt自動(dòng)壓力泵產(chǎn)生穩(wěn)定的壓力，而4D Cell的細(xì)胞限制器提供對(duì)培養(yǎng)微環(huán)境的測(cè)微控制。

細(xì)胞壓縮和空間控制的結(jié)合提供了對(duì)受限空間和機(jī)械應(yīng)力下細(xì)胞行為的洞察，增加了體外細(xì)胞分析的轉(zhuǎn)化價(jià)值。

機(jī)械生物學(xué)研究的優(yōu)勢(shì)

1、控制壓力和物理空間：機(jī)械應(yīng)力分析的理想選擇

2、允許在不同的壓力設(shè)置之間快速切換：用于實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞對(duì)機(jī)械刺激的反應(yīng)

3、穩(wěn)定和無脈沖壓力：對(duì)細(xì)胞壓縮的全面和穩(wěn)定控制

4、非破壞性細(xì)胞分析：回收您的細(xì)胞以便進(jìn)行分子分析

5、瞬時(shí)啟動(dòng)和停止壓力：快速觸發(fā)和釋放約束限制

應(yīng)用領(lǐng)域

● 細(xì)胞限域測(cè)定

● 動(dòng)態(tài)細(xì)胞行為

● 細(xì)胞遷移和癌癥轉(zhuǎn)移

● 機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)

● 細(xì)胞遷移可塑性

● 細(xì)胞對(duì)機(jī)械應(yīng)力的反應(yīng)

● 活細(xì)胞成像

● 細(xì)胞分裂

● 機(jī)械誘導(dǎo)的細(xì)胞修復(fù)

● 細(xì)胞分裂過程中的基因組不穩(wěn)定性

● 傷口愈合和炎癥研究

● 細(xì)胞包埋

有用介紹鏈接

使用微流體保護(hù)DNA免受機(jī)械應(yīng)力：here 

機(jī)械細(xì)胞壓縮：here

機(jī)械生物學(xué)套裝包含的組件

微流體的驚人優(yōu)勢(shì)可應(yīng)用于許多細(xì)胞和生物學(xué)灌注實(shí)驗(yàn)與應(yīng)用。因此，可以調(diào)整套裝內(nèi)的組件以滿足您的特定需求。

● 1×Cobalt自動(dòng)微流體泵

● 1×安全儲(chǔ)液罐

● 3×4Dcell Confiner（PDMS吸盤）：PDMS環(huán)形模板 - 將細(xì)胞的播種區(qū)域劃定到施加限制的區(qū)域；

● 12×Confinment slides（限制片）：（1）包含PDMS微結(jié)構(gòu)（支柱）的10mm直徑玻璃蓋玻片；（2）限制高度從1到20μm（您可以為您的套件選擇多達(dá)3個(gè)不同的高度參數(shù)）；

● 1×導(dǎo)管和連接件套裝

● 3×PDMS環(huán)形模板 - 將細(xì)胞的播種區(qū)域劃定到施加限制的區(qū)域