根據(jù)NCBI的ClinVar數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計，包括罕見疾病，如鐮狀細胞病、地中海貧血和先天性萊伯黑朦等超過3萬7千種已知疾病與致病性單核苷酸變異（SNV）有關，SNV可能導致原始DNA序列、轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)序列等其他特性的變化。而新一代CRISPR/Cas9技術(shù)——堿基編輯器（BEs）可以有效地修復堿基突變，而不會誘導雙鏈DNA斷裂，從而能夠直接、不可逆地校正堿基突變，對于治愈SNV引起的遺傳疾病具有十分廣闊的前景。已經(jīng)報道的有誘導C·G到T·A轉(zhuǎn)化的胞嘧啶堿基編輯器（CBE）、誘導A·T到G·C轉(zhuǎn)化的腺嘌呤堿基編輯器（ABE）和使C·G到G·C轉(zhuǎn)換的糖基化酶堿基編輯器（GBE），這些BEs為治 療50%以上致病性SNV提供了幾乎理想的解決方案。

然而，在實施基于BE的基因療法之前，有必要大量構(gòu)建具有致病性SNV的細胞疾病模型，以用于開發(fā)和優(yōu)化BEs，并使其在基因治 療中的應用成為可能。同時，根據(jù)ClinVar的數(shù)據(jù)，大約50%的人類致病性SNV是C·G到T·A的轉(zhuǎn)化，然而目前很難通過合理的人力和資金投入獲得大量攜帶這些SNV的細胞模型。這一方面是由于大規(guī)模樣品，手動操作不僅耗時，而且容易出錯，一致性較差且成本高昂；另外一方面，現(xiàn)有的基于目標-位點集成庫的方法，如Be-Hive等在為AI學習和預測編輯性能的數(shù)據(jù)時，缺乏原位信息的綜合編輯位點數(shù)據(jù)，同時又缺少真實染色體環(huán)境（先前研究表明，核酸酶的性能與染色質(zhì)可及性之間存在很強的相關性，并且基因編輯在真核染色質(zhì)中比異染色質(zhì)中更有效）。

中科院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所和天津科技大學的團隊，開發(fā)了一個由以下四個模塊組成的用于哺乳動物細胞高通量原位基因編輯的自動化平臺，實現(xiàn)了哺乳動物細胞基因編輯的標準化和可拓展性。

（1）內(nèi)源性靶g(shù)RNA計算機輔助設計；

（2）gRNA表達質(zhì)粒構(gòu)建；

（3）哺乳動物細胞堿基編輯；

（4）CBEs性能模型構(gòu)建的機器學習。

四個模塊組成的用于哺乳動物細胞高通量原位基因編輯的自動化平臺，實現(xiàn)了哺乳動物細胞基因編輯的標準化和可拓展性。該平臺借助大規(guī)模的原位編輯數(shù)據(jù)和序列信息，結(jié)合局部染色質(zhì)可及性，具有原位數(shù)據(jù)的機器學習模型能夠更好地預測實際的堿基編輯效率，使獲得內(nèi)生目標的大規(guī)模編輯數(shù)據(jù)集成為可能。

圖1 全自動高通量哺乳動物基因編輯平臺概覽

在這四個模塊中，第 一個模塊用于負責gRNA設計，以將人類致病性SNV引入野生型細胞，作者使用生物信息學分析選擇了1210個基因作為靶位點，使用包含每個靶位點上游3 bp至下游750 bp靶區(qū)的DNA序列，分批處理用于分析編輯結(jié)果的三對引物。對于自動化gRNA質(zhì)粒構(gòu)建工作流程模塊，gRNAs質(zhì)粒構(gòu)建過程中采用了貝克曼庫爾特Echo納升級聲波移液系統(tǒng)用于操縱DNA組裝反應，相對于標準的Golden Gate DNA組裝方法的反應體積為15μl，Echo的納升級和無吸頭操作能夠?qū)嶒灢襟E進行一系列優(yōu)化，將反應系統(tǒng)最小化到1微升的總體積，從而顯著降低了實驗成本。

隨后使用貝克曼庫爾特Biomek i7自動化移液工作站將DH5α感受態(tài)細胞與Golden Gate產(chǎn)物進行混合，通過ClonePix進行轉(zhuǎn)化鋪板，并在通過DNA測序驗證構(gòu)建質(zhì)粒之后，使用Biomek i7進行質(zhì)粒提取。為了分析數(shù)據(jù)編輯結(jié)果，使用Python腳本讀取sanger測序文件，比較N20，并創(chuàng)建兩個參考csv文件。錯誤的組裝csv文件包括一個選擇列表，用于從48孔細菌菌落板到96孔深孔板中挑選新菌落，以便ClonePix進行另一輪驗證。正確組裝csv文件包含N20測序及其在96孔深孔板中的位置，用于使用貝克曼庫爾特Biomek i7自動化移液工作站進行質(zhì)粒提取。此模塊高通量自動化系統(tǒng)在4天之內(nèi)共構(gòu)建和分析了1210個gRNA質(zhì)粒，成功率達99%，實現(xiàn)了每天384個gRNA組裝的通量。而后續(xù)使用Biomek i7進行的質(zhì)粒提取，通量則可達到576個質(zhì)粒/天。

圖2 全自動gRNA質(zhì)粒構(gòu)建工作流程概述示意圖

第三個模塊是哺乳動物細胞中的堿基編輯，如圖3。通過優(yōu)化實驗條件，作者開發(fā)了使用Biomek i7自動化移液工作站進行包括細胞接種和轉(zhuǎn)染、細胞培養(yǎng)基更換以及進行樣品收集在內(nèi)的編輯過程。隨后進行靶區(qū)域的細胞裂解和PCR擴增。全自動高通量系統(tǒng)在6h內(nèi)將1210組gRNA和BE4max質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中，并在2 h內(nèi)完成后續(xù)培養(yǎng)基更換。培養(yǎng)5天后，收獲編輯的細胞于8小時內(nèi)完成進行PCR分析，然后進行sanger測序。使用Python腳本產(chǎn)生3個csv文件，一個用于準備新一輪PCR的挑選列表，以分析使用Biomek i7從96孔裂解樣品板到96孔PCR板的false sample；第二個csv文件包含用于分析false sample的第二個引物對的序列和位置信息，用于新一輪PCR；第三個csv文件包含正確的樣本和編輯效率結(jié)果，用于下一步的AI學習。

圖3 自動化基因編輯過程的工作流程概述

第四個模塊為作者開發(fā)的AI模型——染色質(zhì)可及性學習模型（CAELM），預測基礎編輯的結(jié)果。CAELM基于自動化平臺生成的高度均勻的原位基因組編輯數(shù)據(jù)，預測HEK4T細胞中的BE293max行為，并實現(xiàn)了0.64的皮爾遜相關值。皮爾遜r是評估數(shù)值數(shù)據(jù)模型準確性的最普遍指標之一，CAELM模型中考慮了目標序列的真實染色體環(huán)境，這提供了更好、更現(xiàn)實的預測；同時，CAELM還提供了模型輸入的特征重要性得分，并揭示了DNA可及性相對于目標序列上下文的貢獻在預測中接近1:6。

通過與32個不同基因組位點的手動操作進行比較，其中16個目標位點在兩個操作過程中的編輯效率幾乎相等，而自動化高通量系統(tǒng)在其他14個位點的統(tǒng)計分析中表現(xiàn)出更高的編輯效率。這些結(jié)果表明，自動化高通量系統(tǒng)能夠以與手動操作相當?shù)男蕡?zhí)行基礎編輯；隨機選擇BE4max編輯靶標的1210個與疾病相關的SNV的編輯效率均達到了較高水平，說明可以同時有效地操縱數(shù)千個內(nèi)源性靶位點的人類細胞的全自動高通量原位基因編輯平臺的成功建立。

Paal-Knorr 反應機理研究

原位檢測與過程分析

01 技術(shù)平臺

原位檢測與過程分析（以下簡稱ICPA）技術(shù)平臺是以RC HP-1000A型反應量熱儀為基礎，并搭載在線分子光譜儀、在線粘度計、在線pH計、在線顆粒度檢測儀等探頭式原位檢測儀器的高技術(shù)多參量測控平臺。通過對上述儀器組件在硬件與軟件層面的集成，可實現(xiàn)化學反應工藝過程模擬、多參量測控、數(shù)據(jù)分析與聯(lián)用等功能。

其中，ICPA技術(shù)平臺的多參量測控功能可原位采集化學反應過程中體系溫度、壓力、反應熱、組分、pH值、粘度和顆粒度等參量的實時數(shù)據(jù)，從而GX獲取化學反應特征信息。由于無須進行取樣、樣品前處理等操作，與傳統(tǒng)的離線分析手段相比，ICPA技術(shù)具有不破壞樣品、不引入干擾因素、不丟失過程信息等優(yōu)勢，可用于反應機理研究、反應風險評估、工藝參數(shù)快速優(yōu)化等。另外，由于具備高自動化、高數(shù)據(jù)通量的特點，該技術(shù)是未來實現(xiàn)全自動化實驗室、智能工廠的重要基礎。

圖1  原位檢測與過程分析技術(shù)平臺組成

圖2  原位檢測與過程分析技術(shù)平臺拓撲結(jié)構(gòu)

02 應用實例

有機化學中從1,4-二羰基化合物產(chǎn)生吡咯、呋喃或噻吩的反應稱為Paal-Knorr反應。取代的吡咯、呋喃和噻吩是許多具有生物活性的天然產(chǎn)物和藥物活性成分（APIs）的基本結(jié)構(gòu)單元，因此Paal-Knorr反應是一類比較有價值的合成方法。對于利用胺類與1,4-二羰基衍生物合成吡咯的Paal-Knorr反應，一般認為半縮醛胺中間體的環(huán)化是反應的決速步驟，因此測定該中間體的生成與變化是研究反應機理的關鍵。

圖3  Paal-Knorr吡咯合成反應機理

本實驗以2,5-己二酮為底料、滴加乙醇胺的方式進行Paal-Knorr吡咯合成。利用ICPA技術(shù)平臺分子光譜（中紅外）原位檢測功能，可表征反應過程中體系紅外吸收光譜隨時間變化。通過對全譜圖進行基線校正和特征峰趨勢分析，可以識別出反應體系各組分濃度的變化，其中波數(shù)1110 cm^-1處的吸收峰呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且符合仲胺基上C-N鍵的伸縮振動峰位置，可初步識別為半縮醛胺中間體的特征峰。

圖4  (a) Paal-Knorr吡咯合成反應紅外光譜隨時間變化；(b) 關鍵特征峰變化趨勢

利用特征峰強度變化可對反應物、產(chǎn)物和中間體的濃度及相對濃度變化過程進行半定量分析。可以發(fā)現(xiàn)，反應物和產(chǎn)物的相對濃度之和在1110 cm^-1吸收峰出現(xiàn)前后恒等于1，且在反應過程中出現(xiàn)的下降趨勢與1110 cm^-1吸收峰的變化趨勢相吻合。由此可以確認1110 cm^-1是半縮醛胺中間體的特征峰。

圖5  反應物、產(chǎn)物、中間體相對濃度變化趨勢

確認中間體的特征峰之后，可以通過原位采集紅外數(shù)據(jù)GX研究工藝條件對反應過程的影響。如圖6所示，提高反應溫度會YZ中間體的生成，驗證了半縮醛胺中間體脫水是Paal-Knorr反應的決速步驟，溫度對這一步反應速率的影響更顯著；另外，投料順序也影響反應過程，以乙醇胺為底料、滴加2,5-己二酮的反應方式?jīng)]有明顯的中間體生成。

圖6  (a)反應溫度與(b)投料順序?qū)χ虚g體生成的影響

03 結(jié)語

ICPA技術(shù)是現(xiàn)代測控技術(shù)、儀器科學和現(xiàn)代計量學的結(jié)合體，是研究化學反應機理與工藝開發(fā)的新興手段。后續(xù)我們將介紹更多ICPA檢測方法以及該技術(shù)在醫(yī)藥、農(nóng)藥、聚合物、新能源等行業(yè)研發(fā)與生產(chǎn)中的應用實例。