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2025-01-10 17:03:44流式細胞分選技術: 流式細胞分選技術是一種先進的細胞分析與分選技術。它利用流式細胞儀，使細胞懸液在高壓驅動下通過噴嘴形成細胞束，在激光照射下發(fā)出熒光和散射光，經檢測系統(tǒng)檢測后，由計算機分析得出細胞的各種參數(shù)，進而根據(jù)預設條件將細胞分為不同亞群并收集。該技術具有高通量、高精度、多參數(shù)分析等優(yōu)點，廣泛應用于免疫學、腫瘤學、細胞生物學等領域，是研究細胞功能、特性和相互作用的重要工具。

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【今晚直播】從定量菌株到認證參考物質

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生物梅里埃 1803
2022-09-25
生物梅里埃工業(yè)微生物流式細胞分選技術

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流式細胞分選技術問答

2017-11-22 01:59:20流式細胞術和流式細胞分選技術的區(qū)別:

2023-06-09 11:41:52人人都是流式高手：Tumor-infiltrating lymphocytes(TILs) 分選秘籍: Tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) 是指浸潤腫瘤組織的淋巴細胞。淋巴細胞是免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，負責識別和攻擊異常細胞，包括癌細胞。流式細胞術對TILs的分選提供了一個重要的工具，用于表征、純化和研究浸潤腫瘤的免疫細胞群。它有助于研究人員了解TILs的組成、功能和潛在的治療相關性，推動我們對腫瘤與免疫相互作用的理解。我們使用流式細胞術來分選TILs主要應用場景如下：01、鑒定和表征：流式細胞術允許我們根據(jù)TILs表面標記物的特征來鑒定和表征不同的亞群。通過使用針對CD3、CD4、CD8和其他免疫細胞標記物的特異性抗體來標記細胞，我們可以區(qū)分和定量TILs中的各種T細胞亞群。這有助于我們了解腫瘤微環(huán)境中TILs的組成和多樣性。02、特定TIL亞群的純化：流式細胞術分選使我們能夠分離和純化感興趣的特定TIL亞群。通過基于表面標記物的表達，對細胞進行分選和篩選，我們可以收集純凈的TIL亞群用于進一步的下游應用。這使研究人員能夠研究特定的TIL亞群，并研究其功能特性或基因表達譜。03、功能分析：分選后的TILs可用于功能性分析，以評估其免疫活性和功能。例如，可以測試分選后的TILs的增殖能力、細胞因子產生、對腫瘤細胞的細胞毒性或其他功能性實驗。這些分析提供了有關TIL亞群功能能力和潛在抗腫瘤免疫反應的見解。04、基因組學或蛋白質組學分析：流式細胞術分選可以獲得純凈的TIL細胞群，進而進行基因組學或蛋白質組學分析。通過分析分選TILs的基因表達或蛋白質譜，研究人員可以更深入地了解與TILs在腫瘤免疫中相關的分子機制和信號通路。然而不同于外周血、脾臟中的淋巴細胞，TILs的流式檢測存在更多的不確定性，需要有效優(yōu)化包括樣本處理、配色方案、上樣條件以及分析方法等實驗設計的各個方面，才能實現(xiàn)更為準確、真實的多色復雜樣本流式檢測。圖1為外周血來源樣本淋巴細胞分型的流式檢測數(shù)據(jù)，由圖可見，淋巴細胞群體T、B細胞分群明顯，T細胞亞群也可清晰區(qū)分。另外，我們也可以看到，該數(shù)據(jù)以FSC通道設定閾值，其閾值設定值較低，導致碎片及噪音信號干擾明顯，不過由于血液樣本碎片較少，與細胞分群明顯，故而對最終結果的影響并不大。圖1 血液樣本淋巴細胞免疫分型流式數(shù)據(jù)然而，當我們使用同樣的模板檢測腫瘤組織樣本時，數(shù)據(jù)就出現(xiàn)了明顯問題。實體瘤組織細胞構成復雜，并且在將組織樣本制備成單細胞樣本的過程中會產生大量的細胞碎片，這些雜質細胞及碎片會對流式檢測造成顯著的干擾。如圖2所示，T細胞中出現(xiàn)了大量CD19和CD3雙陽性細胞，不符合已有文獻報道的結果。這些雙陽性細胞主要是由于雜質細胞及碎片的非特異干擾導致的。這些干擾對于流式檢測及流式分選的準確性有很大影響，甚至會導致得出錯誤的結論。圖2 浸潤腫瘤組織的淋巴細胞免疫分型流式數(shù)據(jù)那么，基于以上數(shù)據(jù)，我們應該如何優(yōu)化實驗設計以提高浸潤腫瘤組織的淋巴細胞分選的準確性呢？這里給大家以下幾點建議：01、增加Pan-Marker檢測：這里的Pan-Marker是指目標細胞群均表達，但其他細胞群體及碎片不表達的表面標記。CD45廣泛表達于免疫系統(tǒng)的各個細胞亞群上，但在非免疫細胞上沒有表達或表達很低。因此，在檢測淋巴細胞等免疫細胞時，可通過檢測CD45是否表達來區(qū)分免疫細胞及非免疫細胞，以達到排除雜質細胞干擾的目的。02、優(yōu)化樣本制備方案：對復雜樣本來講，樣本制備方案是否合適決定了流式實驗的成功率。可根據(jù)文獻報道并通過預實驗來選擇最佳的消化酶配方和消化時間，在確保細胞得率的同時盡量減少雜質干擾并最大限度的保存細胞活性及功能。此外，選擇合適的細胞分離手段進行目的細胞的富集。例如，若針對淋巴細胞檢測，利用Ficoll或Percoll密度梯度離心法富集單個核細胞，可有效去除脂肪、碎片及雜質細胞的干擾。03、進行Fc封閉：組織浸潤的多種細胞，特別是單核/巨噬細胞以及DC細胞高表達抗體Fc端的受體。這些細胞在進行流式抗體標記時，即使不表達相關抗原，也可通過Fc受體非特異性的結合流式抗體的Fc端，從而導致非特異信號。要解決這一問題，可購買商業(yè)化Fc封閉試劑，在標記流式抗體前進行Fc封閉即可。04、合理設定閾值：閾值的設定與實驗目的息息相關。在流式分析實驗中，應當設定閾值去除絕大部分噪音及碎片信號，僅保留少量碎片信號即可。在流式分選實驗中，若分選所得細胞用于培養(yǎng)，同樣應當設定閾值去除絕大部分噪音及碎片信號，僅保留少量碎片信號，這樣做可以有效提高分選效率及回收率；但若分選所得細胞用于qPCR、測序，特別是單細胞測序等基因組學應用，由于碎片中含有一定量的核酸片段乃至細胞核碎片，在分選過程中就需要將盡可能多的碎片與目的細胞區(qū)分，因此應當設定較低的閾值以暴露足量的碎片信號讓分選儀器檢測到，進而有效確保分選所得目的細胞不摻雜核酸碎片，以免影響后續(xù)實驗準確性。05、利用空白熒光通道排除非特異：什么是空白熒光通道呢?舉一個例子，我們設計一個3色實驗標記FITC、PE、PE-Cy7三種染料，沒有標記APC，在檢測時APC通道就是空白通道，是不應該有陽性信號的。復雜樣本中的部分雜質細胞有較強的非特異熒光信號，通常這些非特異的熒光信號在所有的流式熒光通道中均可檢測到?；谶@一原理，我們可在上樣時預留一到兩個空白熒光通道，樣本中的目的細胞沒有標記這些空通道的熒光素，在這些通道里面是陰性的，而雜質細胞的非特異信號在空白通道中通常也是陽性的，我們就可以通過設門選擇空白通道中的陰性細胞來達到去除非特異信號的目的。需要注意的是，利用這一方法時要充分考慮補償?shù)挠绊?，?好選擇與已用通道補償小或無補償?shù)耐ǖ雷鳛榭瞻淄ǖ馈?6、增加細胞死活染料：死細胞的非特異性地結合會增加假陽性。死細胞會產生自發(fā)熒光干擾特定信號的檢測。在TILs分選中去除死細胞?？梢栽黾訑?shù)據(jù)準確性：死亡的細胞可能會釋放細胞碎片和細胞內成分，這可能會干擾實驗結果，引入假陽性或假陰性結果。通過去除死細胞，可以提高分選結果的準確性和可靠性。并且為分選后TILs細胞活力提供保證：分選到活細胞可以保證后續(xù)實驗的有效性和可靠性。死亡細胞不具備正常的生物活性和功能，因此分選到活細胞可以確保后續(xù)實驗能夠反映真實的細胞生物學狀態(tài)。圖3 無死細胞排除處理的樣本分析比較圖4 有死細胞排除處理的樣本分析比較復蘇后的PBMC在免疫染色之前不添加（圖 3）或者添加ViaKrome 405可固定活性染料（55℃，10分鐘）（圖 4）。然后，使用Perfix-nc細胞染色試劑盒（型號 B10825）處理細胞，并用Granzyme B-FITC、CD19-PE、CD14-ECD、CD79a-PC5.5、CD3-PC7 和 CD45- Krome Orange 進行染色。數(shù)據(jù)統(tǒng)計信息顯示：兩個不同條件下，門內細胞在上一門級百分比也不一樣，充分展示了消除死細胞以后的數(shù)據(jù)效果。

2023-07-03 11:42:58人人都是流式高手：GFP分選，這還有我不會的？: 很常見的場景如下：細胞轉染后，想用流式檢測表達GFP細胞的百分比并且分選，但是不同的設門方法讓GFP陽性細胞百分比看起來有差異，究竟下面哪種策略才適合呢？今天我們主要討論一下FSC和SSC上設門對GFP陽性細胞百分比的影響。讓我們一個一個設門，把每種情況具體看一下。保持FITC通道上的門不變，我們來看一下在前向和側向的散點圖上設門在不同的位置，代表你選擇了什么類型的細胞。只有P1賦予了藍色，其他門的顏色去掉，這樣，我們就可以很方便的看出來細胞群在不同的圖上所處的位置。第一種設門，除了左下角靠近0的碎片不圈，其他基本都圈上，從第二張SSC-A和SSC-H排粘連的散點圖可以看出來有單個細胞也有粘連細胞，P2門下 GFP陽性細胞百分比為61.36%。第二種設門，只圈最密集的這一群，從第二張SSC-A和SSC-H排粘連的散點圖可以看出來，這部分的細胞基本都是單個的，P2門下 GFP陽性細胞百分比為65.39%，較第一種高。第三種設門，密集細胞群左邊的和左下角靠近0的碎片不圈，只圈右邊的這兩群，從第二張SSC-A和SSC-H排粘連的散點圖可以看出來有單個細胞也有粘連細胞，P2門下 GFP陽性細胞百分比為65.70%，較第一種高，和第二種差不多，但是稍微高一點。這樣分析下來，大家最大的困惑是這三群細胞要不要圈，怎么圈才是最好的？讓我們在第一張FSC和SSC的散點圖上根據(jù)細胞群設三個門。三個門分別為P1、P4和P5，顯示了三種不同的細胞群。P1顯示為單個細胞，F(xiàn)ITC通道上陽性細胞比例為65.54%。P4顯示大部分為粘連的細胞，因此在FITC通道上的陽性細胞比例為71.43%，較P1細胞群高，如果分析時加入這群細胞會增加GFP陽性細胞百分比。如果在單克隆分選中選擇這群，會導致雖然篩選到陽性細胞，但是單克隆源性降低。P5顯示為單個細胞，但是因為FSC較P1小，考慮是細胞狀態(tài)不好細胞呈現(xiàn)皺縮導致，所以其在FITC通道上的陽性細胞比例為20.15%，較P1細胞群低的多，如果分析時加入這群細胞則會降低GFP陽性細胞百分比。如果加入7AAD染料，這群會呈現(xiàn)出陽性，所以在分選中這群細胞不該圈選，或者在去除死細胞的門中去除。由此可見，如果只想要分析狀態(tài)好的單個細胞的GFP陽性百分比，那你可以選擇P1門的設門方式，當然也可以把P1和P4都選上，再用SSC-A和SSC-H去掉粘連細胞對數(shù)據(jù)的干擾。練習題如果您在細胞轉染后，流式檢測表達mCherry細胞的百分比時發(fā)現(xiàn)，mCherry通道細胞群并沒有呈現(xiàn)明顯分開的兩群（由于細胞在mCherry通道有較高的自發(fā)熒光），要怎么確定mCherry細胞百分比并且分選呢？

2022-12-01 20:08:12流式高手來PK | 流式分選小技巧投票評選: 為期10天的流式分選小技巧征集已經結束啦，大家對流式分選都有很多心得哦。經過5位貝克曼應用和市場專家的評選，有11位小伙伴的作品入圍本輪大眾投票。讓我們先來“康康”其中兩個吧~小技巧1：對于單克隆的孔板分選，可以適當稀釋樣本。放慢進樣流速。得到活率更好的單細胞。對于細胞團塊：在樣本里加入適當?shù)腅DTA和DNAase來防止。對于極脆弱的細胞分選：可以讓儀器運行時的進樣壓差控制在0.5以內。小技巧2：在細胞制備、培養(yǎng)階段，如果該培養(yǎng)細胞是貼壁細胞，需用先用胰酶消化細胞，然后收集待測樣品細胞，離心、洗滌、封閉后標記熒光素偶聯(lián)抗體即可。還有很多非常實用的小技巧如果你也喜歡，就去掃碼為他點個贊吧！我們將根據(jù)點贊票數(shù)評選：一等獎：Apple AirPods Por降噪耳機二等獎：西部數(shù)據(jù)移動硬盤三等獎：機械鍵盤*其他入圍作品也可以獲得入圍獎：超聲波眼鏡清洗機沒有入圍的小伙伴不要灰心，我們還有早鳥獎放送哦~投票時間2022年12月1日-12月7日掃描上方二維碼快來你最心怡的3個小技巧點贊投票吧！*投票結束10個工作日會郵寄獎品，請大家關注哦！

2022-11-22 20:20:26流式高手來PK | 流式分選小技巧有獎征集: 你有沒有被這些問題困惑：什么方法可以提高分選的細胞得率？分選樣本制備的時候怎樣避免團塊？液流如何才能保持穩(wěn)定？……遇到這些問題你又是怎樣用聰明的小腦袋解決的呢？比如當我們發(fā)現(xiàn)分選細胞死亡率高，可以通過調整collecting buffer改善。以293T細胞為例，collecting buffer中添加FBS或BSA可以顯著降低細胞死亡率至5%以下[1]。你有什么流式分選的小技巧呢？快來參與流式高手PK大賽，把你的分選小技巧分享給大家吧！還有驚喜好禮等著滿滿才氣的你哦~