熒光顯微鏡是一種利用熒光的成像技術(shù)，通過內(nèi)在發(fā)射或人工添加熒光團(tuán)，以提供與顯微鏡圖像的對比。在生物醫(yī)學(xué)成像中，由于使用多種熒光標(biāo)記，不同的熒光團(tuán)可用于同時識別特定的目標(biāo)分子和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，提供高度的特異性和選擇性。在材料科學(xué)中，熒光(光致發(fā)光)顯微鏡可以用來觀察發(fā)光納米粒子和半導(dǎo)體表面缺陷的圖像。

Fig. 1 Composite Widefield fluorescence image of bovine pulmonary artery endothelial (BPAE) cells acquired using the FS5 Spectrofluorometer with microscope add-on.

熒光顯微鏡可以獲取詳細(xì)的細(xì)胞圖像，如圖1所示的牛肺動脈內(nèi)皮(BPAE)細(xì)胞。BPAE細(xì)胞含有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme, ACE)，它是通過收縮和擴(kuò)張血管來調(diào)節(jié)血壓的重要成分。在這個BPAE樣品中，不同的細(xì)胞成分被用不同顏色的熒光染料標(biāo)記，以便觀察細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。本文將詳細(xì)說明使用愛丁堡儀器FS5熒光光譜儀和顯微鏡附件獲得像上述BPAE的熒光圖像，以及發(fā)射光譜和壽命衰減光譜。

實(shí)驗(yàn)部分

樣品來自Invitrogen公司的FluoCells?制備的玻片#1，其中含有牛肺動脈內(nèi)皮(BPAE)細(xì)胞。BPAE細(xì)胞用不同的熒光染料的染色標(biāo)記，不同染料針對細(xì)胞中的特定結(jié)構(gòu)。MitoTracker?Red CMXRos標(biāo)記線粒體（紅色），Alexa Fluor?488 phalloidin用于標(biāo)記絲狀肌動蛋白（綠色），DAPI用于標(biāo)記細(xì)胞核（藍(lán)色）。

Fig. 2 FS5 Spectrofluorometer coupled to a fluorescence microscope.

文中所有的測試使用愛丁堡儀器FS5熒光光譜儀與尼康Ni-U正置熒光顯微鏡耦合實(shí)現(xiàn)。FS5通過裝載液體光導(dǎo)臺，激發(fā)和發(fā)射光通過液體光導(dǎo)與顯微鏡耦合。FS5配置穩(wěn)態(tài)激發(fā)的150W氙燈， TCSPC壽命模塊，及電制冷PMT-980探測器。該實(shí)驗(yàn)中的顯微鏡配置CMOS熒光成像相機(jī)進(jìn)行寬場視野的熒光成像，激發(fā)和發(fā)射側(cè)光譜液體光導(dǎo)耦合接口，以及用于耦合愛丁堡皮秒脈沖激光器EPL-37的激光器耦合接口。

測試結(jié)果

 熒光寬場成像圖 

為了獲得BPAE細(xì)胞的寬場熒光圖像，將FS5和顯微鏡進(jìn)行耦聯(lián)。激發(fā)光源為FS5的150 W穩(wěn)態(tài)Xe燈，使用SC-50光導(dǎo)樣品臺將激發(fā)單色器選擇的所需波長導(dǎo)入至激發(fā)側(cè)液體光導(dǎo)。激發(fā)光通過寬場激發(fā)耦合接口進(jìn)入顯微鏡中，進(jìn)入二向色片和物鏡中進(jìn)行樣品的激發(fā)。樣品的熒光信號通過物鏡采集及透過二向色片，通過發(fā)射帶通濾光片選擇所需的熒光波長，并使用CMOS相機(jī)進(jìn)行成像。BPAE細(xì)胞用三種不同顏色的熒光染料標(biāo)記，以顯示細(xì)胞內(nèi)不同的細(xì)胞器。為了獲得細(xì)胞的完整圖像，使用不同的激發(fā)波長、二向色片和針對每種染料優(yōu)化的帶通濾光片獲得了三張BPAE的獨(dú)立圖像。

Fig. 3 Widefield fluorescence image of bovine pulmonary artery endothelial (BPAE) cells. a) Green emitting filamentous F-actin, λex = 480nm with a 520±14 nm emission bandpass. b) Red emitting mitochondria, λex = 580nm with a 641±38 nm emission bandpass. c) Blue emitting nuclei, λex = 380nm with a 447±35 nm emission bandpass. d) Composite image of BPAE (combination of images a, b and c)

圖3a - 3c分別為Alexa Fluor?488標(biāo)記的絲狀肌動蛋白、MitoTracker?Red CMXRos標(biāo)記的線粒體和DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核的單獨(dú)寬場熒光圖像。然后將這些單獨(dú)的圖像進(jìn)行組合，形成如圖3d所示的復(fù)合圖像，顯示出完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。FS5的氙燈和激發(fā)單色器提供了從200到1000 nm的可調(diào)諧的激發(fā)光源;與傳統(tǒng)顯微鏡中基于濾光片的激發(fā)源波長選擇相比，具有更大的波長選擇及靈活性。激發(fā)單色器與液體光導(dǎo)耦合避免了白光燈源作為熒光顯微鏡光源時常見的缺點(diǎn);如需要對燈源校正或者光源熱量破壞樣品。 熒光光譜 通過使用FS5將熒光重新定位至發(fā)射測液體光導(dǎo)中進(jìn)行檢測，測量BPAE細(xì)胞的熒光發(fā)射光譜。使用這種方法，在380 nm處激發(fā)BPAE細(xì)胞細(xì)胞核中的DNA結(jié)合的染料DAPI，獲得如圖4所示的熒光光譜。

Fig.4 Fluorescence spectrum of DNA-bonded DAPI. 

熒光壽命 耦合熒光顯微鏡的FS5也可用于獲取標(biāo)記BPAE細(xì)胞的熒光壽命。對于熒光壽命測量，使用激光激發(fā)耦合器將脈沖二極管激光源安裝在顯微鏡上，相機(jī)和顯微鏡樣品臺用于將激光束聚焦到樣品中的特定關(guān)注的樣品測試點(diǎn)。使用FS5的發(fā)射單色儀選擇所需的發(fā)射波長，并使用TCSPC獲取熒光衰減。利用EPL-375脈沖二極管激發(fā)細(xì)胞核內(nèi)dna鍵合DAPI, TCSPC在460 nm處獲得的熒光衰減如圖5所示。壽命衰減曲線使用FS5的Fluoracle?操作軟件進(jìn)行擬合，顯示平均壽命為1.85 ns。

Fig.5 Fluorescence decay of DNA-bonded DAPI acquired using TCSPC.

結(jié)論

使用FS5熒光光譜儀與顯微鏡耦合觀察熒光標(biāo)記的BPAE細(xì)胞。以FS5氙燈為連續(xù)激發(fā)源，獲得細(xì)胞的寬場視野的熒光圖像，揭示細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和特征。通過測量熒光標(biāo)記的熒光光譜和壽命，進(jìn)一步了解熒光標(biāo)記的性質(zhì)。本文突出了FS5在搭載顯微附件時時的測量通用性及靈活性; 能夠輕松獲得圖像，光譜和壽命信息。此外，F(xiàn)LS熒光光譜系列耦合方案及熒光壽命成像功能附件也可在愛丁堡儀器上輕松實(shí)現(xiàn)，更多詳情可關(guān)注公眾號進(jìn)行咨詢。