冷凍電鏡技術是在20世紀70年代提出的，早在20世紀70年代科學家們就利用冷凍電鏡研究病毒分子的結構，首次提出了冷凍電鏡技術的原理、方法以及流程的概念。

冷凍電鏡的發(fā)展

　　冷凍電鏡到底是什么?從上世紀70年代興起至今，冷凍電子顯微技術(cryo-EM)已經(jīng)跨越了40多年的發(fā)展歷史，經(jīng)歷了冷凍制樣、單顆粒圖像分析和三維重構算法等關鍵性技術的突破。通俗而言，冷凍電鏡就是在傳統(tǒng)透射電子顯微鏡之上，加上了低溫傳輸系統(tǒng)和冷凍防污染系統(tǒng)。

　　冷凍電子顯微技術主要包括單顆粒冷凍電鏡技術和冷凍電子斷層掃描技術。單顆粒冷凍電鏡技術首先捕獲大量隨機分布的同一種生物樣品的二維圖像，然后通過圖像處理算法解析其三維結構。

　　近年來，隨著冷凍電鏡設備和計算機軟硬件的快速發(fā)展，特別是隨著直接電子探測器在冷凍電鏡中的應用，單顆粒冷凍電鏡技術邁進了原子分辨率水平，在生物學、醫(yī)學和新藥研發(fā)等領域發(fā)揮著越來越重要的作用。

　　冷凍電鏡通過記錄單個生物樣品在傾斜旋轉過程中投影的一系列二維圖像，采用特殊的算法計算，將二維圖像重構為三維斷層圖像。冷凍電鏡主要研究組織、細胞和微生物中的超微結構，它能夠提供生理環(huán)境下大分子復合物納米、亞納米甚至近原子尺度的原位結構信息以及其與其它大分子的相互作用信息。

冷凍電鏡的原理

　　冷凍電子顯微學解析生物大分子及細胞結構的核心是透射電鏡成像，其基本過程包括樣品制備、透射電鏡成像、圖像處理及結構解析等幾個基本步驟。在透射電鏡成像中，電子槍產(chǎn)生的電子在高壓電場中被加速至亞光速并在高真空的顯微鏡內部運動，根據(jù)高速運動的電子在磁場中發(fā)生偏轉的原理，透射電鏡中的一系列電磁透鏡對電子進行匯聚，并對穿透樣品過程中與樣品發(fā)生相互作用的電子進行聚焦成像以及放大，Z后在記錄介質上形成樣品放大幾千倍至幾十萬倍的圖像，利用計算機對這些放大的圖像進行處理分析即可獲得樣品的精細結構。

　　透射電鏡成像過程中，電子束穿透樣品，將樣品的三維電勢密度分布函數(shù)沿著電子束的傳播方向投影至與傳播方向垂直的二維平面上。1968年，AronKlug發(fā)現(xiàn)ZX截面定理，提出可以通過三維物體不同角度的二維投影在計算機內進行三維重構來解析獲得物體的三維結構。根據(jù)這一原理，利用透射電鏡獲得生物樣品多個角度的放大電子顯微圖像，即有可能在計算機里重構出它的三維空間結構。

　　在冷凍電子顯微學結構解析的具體實踐中，依據(jù)不同生物樣品的性質及特點，可以采取不同的顯微鏡成像及三維重構方法。目前主要使用的幾種冷凍電子顯微學結構解析方法包括：電子晶體學、單顆粒重構技術、電子斷層掃描重構技術等，它們分別針對不同的生物大分子復合體及亞細胞結構進行解析。

　　1、電子晶體學

　　利用電子顯微鏡對生物大分子在一維、二維以致三維空間形成的高度有序重復排列的結構(晶體)成像或者收集衍射圖樣，進而解析這些生物大分子的結構，這種方法稱為電子晶體學。其適合的樣品分子量范圍為10~500kD，Zgao分辨率約0.19nm。該方法與X射線晶體學的類似之處在于均需獲得高度均一的生物大分子的周期性排列，不同之處是利用電子顯微鏡除了可以獲得晶體的電子衍射外還可以通過獲得晶體的圖像來進行結構解析。

　　2、單顆粒技術

　　對分散分布的生物大分子分別成像，基于分子結構同一性的假設，對多個圖像進行統(tǒng)計分析，并通過對正、加和平均等圖像操作手段提高信噪比，進一步確認二維圖像之間的空間投影關系后經(jīng)過三維重構獲得生物大分子的三維結構方法。其適合的樣品分子量范圍為80~50MD，Zgao分辨率約0.3nm。利用單顆粒技術獲得三維重構的方法主要包括等價線方法、隨機圓錐重構法、隨機初始模型迭代收斂重構等方法，其基本目標是獲得二維圖像之間正確的空間投影關系，從而進行三維重構。

　　3、電子斷層掃描成像技術

　　通過在顯微鏡內傾轉樣品從而收集樣品多角度的電子顯微圖像并對這些電子顯微圖像根據(jù)傾轉幾何關系進行重構的方法稱為電子斷層掃描成像技術。該方法主要應用于細胞及亞細胞器，以及沒有固定結構的生物大分子復合物(分子量范圍為800kD)，Zgao分辨率約2nm。

冷凍電鏡的分類

　　目前我們討論的冷凍電鏡基本上指的都是冷凍透射電鏡，但是如果我們以使用冷凍技術的角度定義冷凍電鏡的話，冷凍電鏡主要可以分為冷凍透射電鏡、冷凍掃描電鏡、冷凍蝕刻電子顯微鏡。

　　1、冷凍透射電鏡

　　冷凍透射電鏡(Cryo-TEM)通常是在普通透射電鏡上加裝樣品冷凍設備，將樣品冷卻到液氮溫度(77K)，用于觀測蛋白、生物切片等對溫度敏感的樣品。通過對樣品的冷凍，可以降低電子束對樣品的損傷，減小樣品的形變，從而得到更加真實的樣品形貌。

　　一臺冷凍透射電鏡的價格在600萬美元左右，價格極其昂貴，它的優(yōu)點主要體現(xiàn)在以下幾個方面：diyi是加速電壓高，電子能穿透厚樣品;第二是透鏡多，光學性能好;第三是樣品臺穩(wěn)定;第四是全自動，自動換液氮，自動換樣品，自動維持清潔。

　　2、冷凍掃描電鏡

　　掃描電鏡工作者都面臨著一個不能回避的事實，就是所有生命科學以及許多材料科學的樣品都含有液體成分。很多動植物組織的含水量達到98%，這是掃描電鏡工作者Z難對付的樣品問題。

　　冷凍掃描電鏡(Cryo-SEM)技術是克服樣品含水問題的一個快速、可靠和有效的方法。這種技術還被廣泛地用于觀察一些“困難”樣品，如那些對電子束敏感的具有不穩(wěn)定性的樣品。各種高壓模式如VP、LVESEM的出現(xiàn)，已允許掃描電鏡觀察未經(jīng)冷凍和干燥的樣品。但是，冷凍掃描電鏡仍然是防止樣品丟失水分的Z有效方法，它能應用于任何真空狀態(tài)，包括裝于掃描電鏡的Peltier臺以及向樣品室內沖以水汽的裝置。冷凍掃描電鏡還有一些其他優(yōu)點，如具有冷凍斷裂的能力以及可以通過控制樣品升華刻蝕來選擇性地去除表面水分(冰)等。

　　3、冷凍蝕刻電子顯微鏡

　　冷凍蝕刻電鏡技術是從50年代開始發(fā)展起來的一種將斷裂和復型相結合的制備透射電鏡樣品技術，亦稱冷凍斷裂或冷凍復型，用于細胞生物學等領域的顯微結構研究。

　　冷凍蝕刻電鏡的優(yōu)點：①樣品通過冷凍，可使其微細結構接近于活體狀態(tài);②樣品經(jīng)冷凍斷裂蝕刻后，能夠觀察到不同劈裂面的微細結構，進而可研究細胞內的膜性結構及內含物結構;③冷凍蝕刻的樣品，經(jīng)鉑、碳噴鍍而制備的復型膜，具有很強的立體感且能耐受電子束轟擊和長期保存。

　　冷凍蝕刻電鏡的缺點：冷凍也可造成樣品的人為損傷;斷裂面多產(chǎn)生在樣品結構Z脆弱的部位，無法有目的地選擇。