冷凍蝕刻技術(shù)是從50年代開始發(fā)展起來的一種將斷裂和復(fù)型相結(jié)合的制備透射電鏡樣品技術(shù)，亦稱冷凍斷裂或冷凍復(fù)型，用于細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域的顯微結(jié)構(gòu)研究。

冷凍蝕刻透射電鏡的特點(diǎn)

　　冷凍蝕刻透射電鏡的優(yōu)點(diǎn)：①樣品通過冷凍，可使其微細(xì)結(jié)構(gòu)接近于活體狀態(tài);②樣品經(jīng)冷凍斷裂蝕刻后，能夠觀察到不同劈裂面的微細(xì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而可研究細(xì)胞內(nèi)的膜性結(jié)構(gòu)及內(nèi)含物結(jié)構(gòu);③冷凍蝕刻的樣品，經(jīng)鉑、碳噴鍍而制備的復(fù)型膜，具有很強(qiáng)的立體感且能耐受電子束轟擊和長(zhǎng)期保存。

　　冷凍蝕刻透射電鏡的缺點(diǎn)：冷凍也可造成樣品的人為損傷;斷裂面多產(chǎn)生在樣品結(jié)構(gòu)Z脆弱的部位，無法有目的地選擇。

冷凍蝕刻透射電鏡的使用方法

　　冷凍蝕刻透射電鏡操作方法按以下步驟進(jìn)行：

　　1、預(yù)處理：取新鮮組織塊，大小為1.5～3～5mm，用2.5%戊二醛固定1～3小時(shí)。為防止冰晶形成，用30%甘油生理鹽水浸泡8～12小時(shí)。

　　2、冷凍斷裂：是在冷凍條件下使樣品變得又硬又脆，用刀劈裂樣品，暴露觀察面。因?yàn)槭怯玫杜训臉悠?，斷裂往往發(fā)生在細(xì)胞被凍結(jié)后較脆弱的部位，多數(shù)是沿細(xì)胞及細(xì)胞器的膜裂開。由于斷裂面是凸凹不平的，所以圖像立體感強(qiáng)。冷凍斷裂時(shí)，刀的作用在于劈裂，而不是切割，所以刀刃不必鋒利，但不能有缺口、油污和水份，還需保持清潔干燥。冷凍復(fù)型的斷裂操作要在真空中進(jìn)行，是因?yàn)檎婵諏?duì)熱傳導(dǎo)性差，能使樣品較長(zhǎng)時(shí)間維持在較恒定溫度下進(jìn)行斷裂操作，同時(shí)也便于進(jìn)行下步的蝕刻處理。

　　3、蝕刻：就是在真空中使冷凍樣品表面上的冰升華。目的是為了暴露出樣品斷裂面上的超微結(jié)構(gòu)，便于噴鍍。一般認(rèn)為Z佳蝕刻深度約為30nm。若蝕刻深度不夠，結(jié)構(gòu)被冰掩蓋不能充分暴露出來，圖像模糊;若蝕刻深度過大，超微結(jié)構(gòu)因其基礎(chǔ)支持不足而倒塌，從而破壞了超微結(jié)構(gòu)。蝕刻深度是由蝕刻速度和蝕刻時(shí)間決定的，而蝕刻速度是受真-3-4-5-6空度、溫度、水蒸汽壓所影響。

　　4、噴鍍：即在樣品斷裂面上噴鍍一層鉑膜及碳膜。鉑膜厚度為2～5nm。為使圖像具有立體感，噴鉑的方向與樣品成45度角。為加固鉑膜強(qiáng)度，再噴鍍一層碳，噴碳的方向與樣品面成90度角。

　　5、剝離：清洗噴鍍后，將樣品取出放入10～30%次氯酸鈉腐蝕液中，樣品漸冒氣泡并與復(fù)型膜分離。隨后用蒸餾水仔細(xì)清洗復(fù)型膜。

　　6、撈膜：將清洗后的復(fù)型膜撈在不加支持膜的400目載網(wǎng)上，待干后冷凍蝕刻透射電鏡觀察。

冷凍蝕刻透射電鏡的應(yīng)用

　　一、冷凍蝕刻表面標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)

　?、傩迈r或固定的細(xì)胞進(jìn)行直接法或間接法免疫標(biāo)記。

　　②PBS(pH7.5)沖洗3min×2，加入1mmol/lMgCl2蒸餾水洗洗3min×3，離心沉集細(xì)胞。

　?、蹖⒓?xì)胞團(tuán)置于小紙板上，入液氮冷卻的Freon中，取出入冷凍蝕刻儀中進(jìn)行斷裂操作，再于-100℃蝕刻1min。

　?、苤谱鰯嗔衙鎻?fù)型。

　　⑤再次氯酸鈉清洗復(fù)型，蒸餾水洗后進(jìn)行觀察。

　　本法可顯示斷裂暴露的PF位于ZY，周圍則是蝕刻后露出來的ES，標(biāo)記物只出現(xiàn)在ES上。

　　二、斷裂-標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)

　　此法是先進(jìn)行冷凍斷裂，再做免疫標(biāo)記，從而可以對(duì)斷裂開的各種膜結(jié)構(gòu)及胞漿斷面進(jìn)行標(biāo)記。

　　1、臨界點(diǎn)干燥法

　?、俟潭ǎ?.0%～2.5%戊二醛PBS液4℃1～2h，PBS沖洗3min×3。如為細(xì)胞懸液，可加入30%BSA后加入1%戊二醛，使BSA凝膠化，將凝膠切成2mm左右的小塊，用30%的甘油—PBS浸透后置于用液氮冷卻的Freon中冷卻。

　　②冷凍斷裂，將冰凍的凝膠小塊放在盛有液氮的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿放置于二氧化碳—液氮槽中，用預(yù)冷的解剖刀切割凝膠小塊進(jìn)行冷凍斷裂。

　?、劢鈨觯盟閴K于30%甘油—1%戊二醛磷酸緩沖液中解凍。

　?、苤脫Q甘油，放入1mmol/l氨基乙酰甘氨酸磷酸液去甘油，PBS沖洗，3min×2。

　?、菝庖邩?biāo)記。

　?、?%鋨酸，室溫固定30min。

　　⑦系列梯度乙醇脫水，臨界點(diǎn)干燥，噴鍍鉑—碳膜，次氯酸鈉清洗復(fù)型，蒸餾水洗，撈于有Formvar膜銅網(wǎng)上冷凍蝕刻透射電鏡觀察。

　　2、超薄切片法

　　步驟：①至⑤同臨界點(diǎn)干燥法。

　　⑥1%鋨酸，室溫固定2h，系列酒精或丙酮脫水，常規(guī)電鏡包埋。

　?、咔邪氡∑?，光鏡定位合適的斷裂部位，再切超薄切片，鈾鉛染色，冷凍蝕刻透射電鏡觀察。