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ELISA試劑盒說明書

本文由 上海索寶生物科技有限公司 整理匯編

2018-09-02 10:00 1405閱讀次數(shù)

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植物防衛(wèi)素/植物抗毒素(PDF)ELISA試劑盒說明書本試劑盒植物防衛(wèi)素/植物抗毒素(PDF)ELISA試劑盒僅供體外研究使用預期應用ELISA法定量測定植物組織、細胞或其它相關樣本中防衛(wèi)素/植物抗毒素(PDF)含量。實驗原理用純化的抗體包被微孔板,制成固相載體,往包被抗PDF抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗PDF抗體、HRP標記的親和素,經過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成Z終的黃色。顏色的深淺和樣品中的PDF呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),計算樣品濃度。試劑盒組成及試劑配制1.酶聯(lián)板:一塊(96孔)1.標準品(凍干品):2瓶,每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,蓋好后靜置10分鐘以上,然后反復顛倒/搓動以助溶解,其濃度為20ng/ml,做系列倍比稀釋(注:不要直接在板中進行倍比稀釋),分別稀釋成20ng/ml,10ng/ml,5ng/ml,2.5ng/ml,1.25ng/ml,0.625ng/ml,0.312ng/ml,樣品稀釋液直接作為標準濃度0ng/ml,臨用前15分鐘內配制。如配制10ng/ml標準品:取0.5ml(不要少于0.5ml)20ng/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,其余濃度以此類推。2.樣品稀釋液:1×20ml/瓶。3.檢測稀釋液A:1×10ml/瓶。4.檢測稀釋液B:1×10ml/瓶。5.檢測溶液A:1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液A1:100稀釋,稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制(每孔100ul),實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時內配制。6.檢測溶液B:1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液B1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。7.底物溶液:1×10ml/瓶。8.濃洗滌液:1×30ml/瓶,使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。9.終止液:1×10ml/瓶(2NH2SO4)。10.覆膜:1×5張操作步驟實驗開始前,請?zhí)崆芭渲坪盟性噭辉噭┗驑悠废♂寱r,均需混勻,混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時,均應用樣品稀釋液進行稀釋,以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。建議各實驗室在操作前先進行預實驗以建立**稀釋倍數(shù)。1.加樣:分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔??瞻卓准訕悠废♂屢?00ul,余孔分別加標準品或待測樣品100ul,注意不要有氣泡,加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,酶標板加上蓋或覆膜,37℃反應120分鐘。為保證實驗結果有效性,每次實驗請使用新的標準品溶液。2.棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液100ul(取1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時內配制),37℃,60分鐘。3.溫育60分鐘后,棄去孔內液體,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分鐘,350ul/每孔,甩干(也可輕拍將孔內液體拍干)。4.每孔加檢測溶液B工作液(同檢測A工作液)100ul,37℃,60分鐘。5.溫育60分鐘后,棄去孔內液體,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分鐘,350ul/每孔,甩干(也可輕拍將孔內液體拍干)。6.依序每孔加底物溶液90ul,37℃避光顯色(30分鐘內,此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,后3-4孔梯度不明顯,即可終止)。7.依序每孔加終止溶液50ul,終止反應,此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性,底物反應時間到后應盡快加入終止液。8.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。在加終止液后立即進行檢測。注:1.每次實驗留一孔作為空白調零孔(不同于空白孔),該孔不加任何試劑,只是Z后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調OD值至零。2.嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫。使用后立即冷藏保存試劑。3.洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入檢測溶液B或底物前確保盡量吸干孔內液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。為防止樣品蒸發(fā),試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內,酶標板加上蓋或覆膜,洗板拍干后請立即加入后步試劑,應避免微孔干燥掉。4.消除板底殘留的液體和手指印,否則影響OD值。5.在儲存和溫育時避免強光直接照射。6.未使用完的酶標板或者試劑,請于2-8℃保存。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。7.建議檢測樣品時均設雙孔測定,以保證檢測結果的準確性。洗板方法手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內的液體;在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內,浸泡1-2分鐘,根據(jù)需要,重復此過程數(shù)次。自動洗板:如果有自動洗板機,應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。特異性本試劑盒可同時檢測重組或天然的植物防衛(wèi)素/植物抗毒素(PDF),且與其它相關蛋白無交叉反應。計算以標準物的濃度為橫坐標(對數(shù)坐標),OD值為縱坐標(普通坐標),在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線(推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析,如curveexpert1.3),根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度,再乘以稀釋倍數(shù);或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實際濃度。注意事項1.洗滌過程非常重要,不充分的洗滌易造成假陽性。2.一次加樣時間**控制在5分鐘內,如標本數(shù)量多,推薦使用多道移液器加樣。3.請每次測定的同時做標準曲線,**做復孔。4.如標本中待測物質含量過高,請先稀釋后再測定,計算時請Z后乘以稀釋倍數(shù)。5.在配制標準品、檢測溶液工作液時,請以相應的稀釋液配制,不能混淆。6.底物請避光保存。說明1.在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染,試劑避免受到微生物的污染,因為蛋白水解酶的干擾將導致出現(xiàn)錯誤的結果。2.小心吸取試劑并嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。請注意在吸取標本/標準品,酶結合物或底物時,**個孔與Z后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,將會導致不同的“預孵育”時間,從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。而且,洗滌不充分將影響試驗結果。3.試劑盒保存:部分試劑保存于-20℃,部分試劑保存于2-8℃,具體以標簽上的標示為準。4.濃洗滌液會有鹽析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶。5.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質,此為正?,F(xiàn)象,不會對實驗結果造成任何影響。6.中、英文說明書可能會有不一致之處,請以英文說明書為準。7.所有的樣品都應管理好,按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。8.有效期:6個月ELISA試劑盒聯(lián)系人:馬先生(先生)部門(職位):銷售(經理)手機號碼:15021200052電話:86-021-54100800/64855665傳真:86-021-54261506所在地:上海公司地址:徐匯區(qū)欽江路15號1405郵政編碼:200233郵件:solarbio@126.com公司網(wǎng)址:http://www.shsolarbio.com

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