本文由 ProteinSimple, a biotechne brand 整理匯編

2016-07-12 00:00 3125閱讀次數(shù)

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roxidase）.⑺3%Blockingbuffer（0.5L）:Add15mgBovineserumalbumininTBSbuffertofinalvolume0.5L,keepat4°Ctopreventbacterialcontamination.⑻0.5%Blockingbuffer（0.5L）:Add2.5mgBovineserumalbumininTBSbuffertofinalvolume0.5L,keepat4°Ctopreventbacterialcontamination.⑼Developingreagent:1mlchlonoaphtholsolution（30mg/mlinmethanol）,add10mlmethanol,addTBSbufferto50mlandadd30ul30%H2O2.⑽Stainingbuffer:Add1gamidoblack18B（0.1%）,250mlisopropanol（25%）and100mlaceticacid（10%）todistilledwaterwithfinalvolume1L.⑾Destainingbuffer:Add350mlisopropanol（35%）and2mlaceticacid（2%）todistilledwaterwithfinalvolume1L.【Procedure】⒈.SeparationofProteinRunanelectrophoreticseparationofknownantigenicproteins.Themethodofseparationdecidedbythecharactersoftargetprotein,butforsufficientlytransferring,themostcommonmethodisSDS-PAGE.Afterseparation,removeuppersideofsamplewellswitharazorblade.Notchingbottomright-handcornerofgelfororientationandputgelintransferbufferuntilreadytouse.⒉.Electrotransfer⑴PreparationofmembraneCutapieceofPVDFmembrane（MilliporeImmobion-P#IPVH00010）accordingtothesizeofgel.Incubateinmethanolforabout1minonarockeratroomtemp.Removemethanolandequilibratemembranein1xtransferbufferuntilreadytouse.⑵Arrangegel-membranesandwichInashallowtray,openthetransfercassette.Putawell-soakedspongepadontheblackpieceofthetransfercassetteandawetted3MMpaperonthespongepad.Placethegelonthepaperandarrangewellsothatallairbubblesareremoved.LaythePVDFmembraneonthetopofgelandremoveanyairbubbles.Placeawettedsheetof3MMpaperoverthePVDFmembraneandremovethebubble.Coveredwiththesecondwell-soakedpad.Closethesandwichwiththewhitepieceofthecassette.Mountthesandwichinthetransfertank;puttheblacksidesneartheblacksideofthedevice.Fillthebuffertankwiththetransferbuffer.⑶Electrotransfer:Attachtheelectrodes.Setthepowersupplyto100V（constantvoltage）for1hat4°C.⒊.Immunodetection⑴MembranestainingDisconnecttransferapparatus,removetransfercassette,andpeel3MMpaperfrommembrane.Removethemembranetoasmallcontainer.Add10mlTBSbufferandwashforshorttime.Cutoutonestripewith5mmwidthandputinanothercleancontainer.Stainthisstripeinstainingbufferfor1min.Destainfor30minindestainingbuffertocheckwhetherproteinhasbeentransferredfromgeltomembraneornot.⑵MembraneblockingandwashingForotherpartofmembrane,pouroffTBSbuffer.Add3%blockingbuffer，rockgentlyforatleast1h.Pouroff3%blockingbufferandrinsebrieflywithTBSbufferthreetimes,5minutesforpertime.⑶FirstantibodyPouroffTBSbuffer.Addfirstantibodyatappropriatedilutionin10ml0.5%blockingbuffer.Rockgentlyforatleast1h;pourofffirstantibodysolutionfrommembraneandwashtwicefor10minuteswithTTBSbuffer.⑷SecondantibodyPouroffTTBSbuffer.Addsecondantibodyatappropriatedilutionin5ml0.5%blockingbuffer.Rockgentlyfor30min,pouroffsecondantibodysolutionfrommembraneandwashtwicefor10minuteswithTTBSbuffer.⑸DetectionPouroffTTBSbufferfrommembraneandadddevelopingreagent,RockPVDFgently,monitoringdevelopment.Whenthebandscanbeseenclearly,stopdevelopmentbywashingmembranewithdistilledwaterfor30minuteswith3changes.【Result】Checkthebandsonmembrane,thebandwithblue-purplecolorcorrespondingtothetargetprotein.實(shí)驗(yàn)材料】1.實(shí)驗(yàn)器材SDS/PAGE實(shí)驗(yàn)相關(guān)材料；電轉(zhuǎn)移裝置；供電設(shè)備；PVDF膜（MilliporeImmobion-P#IPVH00010）；Whatman3MM紙；其他工具：鑷子、海綿墊、剪子、手套、小塑料或玻璃容器、淺盤。Detection2.實(shí)驗(yàn)試劑⑴10x轉(zhuǎn)移緩沖溶液（1L）：30.3gTrizmabase（0.25M）,144g甘氨酸（1.92M）,加蒸餾水至1L,此時(shí)pH約為8.3，不必調(diào)整。⑵1x轉(zhuǎn)移緩沖溶液（2L）：在1.4L蒸餾水中加入400ml甲醇及200ml10x轉(zhuǎn)移緩沖溶液。⑶TBS緩沖溶液:將1.22gTris（10mM）和8.78gNaCl（150mM）加入到1L蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)pH至7.5。⑷TTBSbuffer：在1LTBS緩沖溶液中加入0.5mlTween20（0.05%）。⑸一抗：兔抗待測蛋白抗體（多克隆抗體）。（6）二抗：辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔。⑺3%封阻緩沖溶液（0.5L）：牛血清白蛋白15mg加入TBS緩沖溶液并定容至0.5L，過濾，在4°C保存以防止細(xì)菌污染。⑻0.5%封阻緩沖溶液（0.5L）：牛血清白蛋白2.5mg加入TTBS緩沖溶液并定容至0.5L，過濾，在4°C保存以防止細(xì)菌污染。⑼顯影試劑：1ml氯萘溶液（30mg/ml甲醇配置），加入10ml甲醇，加入TBS緩沖溶液至50ml，加入30ul30%H2O2。⑽染色液：1g氨基黑18B（0.1%），250ml異丙醇（25%）及100ml乙酸（10%）用蒸餾水定容至1L。⑾脫色液：將350ml異丙醇（35%）和20ml乙酸（2%）用蒸餾水定容至1L。[詳細(xì)]

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  SantaCruz，SantaCruz代理，SantaCruz北京代理，SantaCruz上海，SantaCruz國內(nèi)代理熱烈祝賀上海起發(fā)獲得SantaCruzZG區(qū)代理2013年9月開始正式簽約SantaCruz，所有產(chǎn)品售后均有上海SantaCruz負(fù)責(zé)，1**%負(fù)責(zé)，并在上海備有20000多種現(xiàn)貨抗體，價(jià)格優(yōu)惠，歡迎廣大經(jīng)銷商咨詢178406/news_328698.html上海起福生物科技有限公司SantaCruz專業(yè)代理，具體產(chǎn)品信息歡迎電詢：4006551678SantaCruzBiotechnologyTECHNICALSERVICEGUIDE:WesternBlottingCatalog#:Lot#:PROBLEMANDPREVIOUSEXPERIENCEWhatisthespecificproblemyouareexperiencing?Whatsizebandswereexpectedandwhatsizebandsweredetected?Wastheblotblankorwasadarkbackgroundornon-specificbandsseen?Didthissamevialofproductworkinthepast?Whatweretheresults?Didotherlotsofthisproductworkinthepast?Whichlots?Whatweretheresults?SAMPLESANDCONTROLSFromwhatspecies（animal）wasthesampleandwhattypeofsamplewasused（celllysate,tissue,purifiedprotein,etc.）?Whatlysisbufferwasused?Howmuchsamplewasloadedonthegel?Iftheblockingpeptidewasused,wasitusedasanegativecontrol?Whatpositiveand/ornegativecontrolswereused,andwhatweretheresults?BLOCKINGWhatweretheblockingconditions（blockingsolution,howlong,whattemperature.Etc.）?上海起福生物科技有限公司聯(lián)系人：楊建輝400電話：4006551678辦公電話：021-50724187傳真：021-50724961*8006手機(jī)：15921799099企業(yè)QQ:4006551678網(wǎng)址:http://www.qfbio.com/地址：上海市浦東新區(qū)繡川路561號1102室[詳細(xì)]

  2018-09-29 10:02

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