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• Wes全自動蛋白質(zhì)印跡定量分析系統(tǒng)產(chǎn)品樣冊

  Wes全自動蛋白質(zhì)印跡定量分析系統(tǒng)產(chǎn)品樣冊[詳細]

  2024-09-11 17:49

  期刊論文

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• 單細胞蛋白質(zhì)定量分析系統(tǒng)

  單細胞蛋白質(zhì)定量分析系統(tǒng)[詳細]

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  應(yīng)用文章

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  Milo單細胞蛋白質(zhì)表達定量分析系統(tǒng)產(chǎn)品樣冊[詳細]

  2024-09-19 11:18

  報價單

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• 蛋白質(zhì)印跡分析（Western Blot Analysis）

  蛋白質(zhì)印跡分析（WesternBlotAnalysis）【實驗?zāi)康摹苛私獾鞍踪|(zhì)印跡法的基本原理及其操作和應(yīng)用。【實驗原理】蛋白質(zhì)印跡法又稱為免疫印跡法，這是一種可以檢測固定在固相載體上蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)技術(shù)方法。待測蛋白既可以是粗提物也可以經(jīng)過一定的分離和純化,另外這項技術(shù)的應(yīng)用需要利用待測蛋白的單克隆或多克隆抗體進行識別。如圖所示，可溶性抗原，也就是待測蛋白首先要根據(jù)其性質(zhì)，如分子量，分子大小，電荷以及其等電點等采用不同的電泳方法進行分離；通過電流將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上；利用抗體（一抗）與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的原理，以抗體作為探針釣取目的蛋白。值得注意的是在加入一抗前應(yīng)首先加入非特異性蛋白，如牛血清白蛋白對膜進行“封阻”而防止抗體與膜的非特異性結(jié)合。經(jīng)電泳分離后的蛋白往往需再利用電泳方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體上,我們把這個過程稱為電泳印跡。常用的兩種電轉(zhuǎn)移方法分別為:1.半干法:凝膠和固相載體被夾在用緩沖溶液浸濕的濾紙之間,通電時間為10分鐘~30分鐘。2.濕法：凝膠和固相載體夾心浸放在轉(zhuǎn)移緩沖溶液中，轉(zhuǎn)移時間可從45分鐘延長到過夜進行。由于濕法的使用彈性更大并且沒有明顯浪費更多的時間和原料，因此我們在這里只描述濕法的基本操作過程。對于目的蛋白的識別需要采用能夠識別一抗的第二抗體。該抗體往往是購買的成品，已經(jīng)被結(jié)合或標(biāo)記了特定的試劑，如辣根過氧化物酶。這種標(biāo)記是利用辣根過氧化物酶所催化的一個比色反應(yīng)，該反應(yīng)的產(chǎn)物有特定的顏色且固定在固相載體上，容易鑒別。因此可通過對二抗的識別而識別一抗，進而判斷出目標(biāo)蛋白所在的位置。其他的識別系統(tǒng)包括堿性磷酸酶系統(tǒng)和125I標(biāo)記系統(tǒng)。【實驗操作】⒈.蛋白質(zhì)的分離根據(jù)目的蛋白的性質(zhì)，利用電泳方法將其進行分離。為提高電轉(zhuǎn)移的效率，通常采用SDS/PAGE技術(shù)。分離實驗結(jié)束后，首先將樣品墻的上邊緣用小刀去除，然后在膠板的右上角切一個小口以便定位，小心放入轉(zhuǎn)移緩沖溶液中待用。⒉.電轉(zhuǎn)移⑴準(zhǔn)備PVDF膜根據(jù)膠的大小剪出一片PVDF膜，膜的大小應(yīng)略微小于膠的大小。將膜置于甲醇中浸泡1分鐘，再移至轉(zhuǎn)移緩沖溶液中待用。夾心放置順序⑵制作膠膜夾心在一淺盤中打開轉(zhuǎn)移盒，將一個預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖溶液浸泡過的海綿墊放在轉(zhuǎn)移盒的黑色篩孔板上，在海綿墊的上方放置經(jīng)轉(zhuǎn)移緩沖溶液浸濕的3MM紙，小心地將膠板放在3MM紙上，并注意排除氣泡。將PVDF膜放在膠的上方同時注意排除氣泡，再在膜的上方放上一張同樣用轉(zhuǎn)移緩沖溶液浸濕過的3MM紙并趕出氣泡，放置另一張浸泡過的海綿墊，關(guān)閉轉(zhuǎn)移盒。將轉(zhuǎn)移盒按照正確的方向放入轉(zhuǎn)移槽中，轉(zhuǎn)移盒的黑色篩孔板貼近轉(zhuǎn)移槽的黑色端，轉(zhuǎn)移盒的白色篩孔板貼近轉(zhuǎn)移槽的白色端，填滿轉(zhuǎn)移緩沖溶液同時防止出現(xiàn)氣泡。⑶電轉(zhuǎn)移連接電源,在4°C條件下維持恒壓100v，1小時⒊.免疫檢測⑴膜染色斷開電源，將轉(zhuǎn)移盒從轉(zhuǎn)移槽中移出，將轉(zhuǎn)移盒的各個部分分開。用鑷子將PVDF膜小心放入一個干凈的容器中，用TBS緩沖溶液進行短暫清洗，從膜上剪下一條寬約5mm的膜放入另一個干凈的容器中。將這條膜在染色液中浸泡1分鐘，然后在脫色液中脫色30分鐘,確定蛋白質(zhì)已經(jīng)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。⑵膜的封閉和清洗對于沒有進行染色的膜，首先倒出TBS緩沖溶液,加入3%封閉緩沖溶液,輕輕搖動至少1小時。倒掉3%封閉緩沖溶液，并用TBS緩沖溶液清洗3次,每次5分鐘。⑶一抗倒掉TBS緩沖溶液，加入10ml0.5%封閉緩沖溶液及適量的一抗，輕輕搖動1小時以上。從容器中倒出一抗及封閉緩沖溶液，用TTBS緩沖溶液清洗兩次，每次10分鐘。⑷二抗倒出TTBS緩沖溶液，加入5ml0.5%封閉緩沖溶液及適量的二抗。輕輕搖動30分鐘，倒出二抗及封閉緩沖溶液，用TTBS緩沖溶液清洗兩次，每次10分鐘。⑸檢測倒掉TTBS緩沖溶液，并加入顯影劑，輕輕搖動PVDF膜，觀察顯影情況，當(dāng)能夠清晰的看到顯色帶時，用蒸餾水在30分鐘內(nèi)分三次清洗PVDF膜以終止顯色反應(yīng)的繼續(xù)進行。【實驗結(jié)果】檢查膜上顯色結(jié)果，藍紫色帶所對應(yīng)的即是目標(biāo)蛋白的位置。WesternBlotAnalysis【Purpose】ComprehendthetheoryofWesternblotting;understanditsbasicmanipulationandapplication.【Principle】WesternblottingisalsocalledImmunoblotting.Itisakindofimmunochemicaltechniqueswhichisusedtodetectaproteinimmobilizedonamatrix.Thetargetproteincanbeinacrudeextractoramorepurifiedpreparationandthemonoclonalorpolyclonalantibodyagainstthisproteinisnecessarytohelpustorecognizetheantigen.AsintheFigure,solubleantigens（thetargetprotein）maybeseparatedbyelectrophoresisbasedonitsmolecularweight（SDS/PAGE）,sizeandcharge（nondenaturatinggelelectrophoresisorisoelectricpoint（isoelectricfocusing）.Aftertheseparation,theproteinsaretransferredfromthegeltoaPVDFmembrane.Onceonthemembraneantibodies（firstantibodies）canbeusedtoprobeforthepresenceofparticularproteinbecauseofthespecificallybindingofantigenwithagainstit.Non-specificbindingsitecanbe“blocked”usingothernon-specificproteinsuchasbovineserumalbuminbeforeaddingfirstantibodytoavoidnon-specificbinding.Proteintransferismostcommonlyaccomplishedbyelectrophoresis，Thisprocedureiscalledelectrophoreticblotting.Thetwocommonelectrophoreticmethodsare:⒈Semi-dryblotting,inwhichthegelandimmobilizingmatrixaresandwichedbetweenbuffer-wettedfilterpapersthroughwhichacurrentisappliedfor10-30minutes.⒉Wet（tank）blotting,inwhichthegel-matrixsandwichissubmergedintransferbufferforelectrophoresis,whichmaytakeaslittleas45minutesormaybeallowedtocontinueovernightWeonlydescribewetblottinghere,sinceitpermitsgreaterflexibilitywithoutbeingsignificantlymoreexpensiveintimeormaterials.Thedetectionoftargetproteinisusingasecondantibody,whichcanrecognizethefirstantibody.Typically,thesecondantibodyispurchasedalreadyconjugatedtoalabe領(lǐng)agentsuchastheenzymehorseradishperoxidase.Thismarkeristhenvisualizedbyacolorimetricreactioncatalyzedbytheenzymewhichyieldsacoloredproductthatremainsfixedtothemembrane.Thus,itispossibletorecognizefirstantibodythroughrecognizingsecondantibody,andthenidentifythepositionoftargetprotein.Otherdetectionsystemsincludealkalinephosphataseand125Ilabels.【Materials】⒈Apparatus:ApparatusofSDS-PAGE,ElectroblottingApparatus,Powersupply,PVDFmembrane（MilliporeImmobion-P#IPVH00010）,Whatman3MMpaper,AdditionalTools:Forceps,spongepad,scissor,gloves,smallplasticorglasscontainer,Shallowtray.⒉Reagents:⑴10xtransferbuffer（1L）:30.3gTrizmabase（0.25M）,144gGlycine（1.92M）,pH首ldbe8.3;withoutadjustment.⑵1xtransferbuffer（2L）:400mlMethanol,200ml10xtransferbuffer,1400mlwater.⑶TBSbuffer:Add1.22gTris（10mM）and8.78gNaCl（150mM）to1LdistilledwaterandadjustpHto7.5withHCl.⑷TTBSbuffer:1LTBSbufferadd0.5mlTween20（0.05%）.⑸Firstantibody:antibodyagainstthetargetprotein.⑹Secondantibody:goatanti-rabbit-HRP（horseradishperoxidase）.⑺3%Blockingbuffer（0.5L）:Add15mgBovineserumalbumininTBSbuffertofinalvolume0.5L,keepat4°Ctopreventbacterialcontamination.⑻0.5%Blockingbuffer（0.5L）:Add2.5mgBovineserumalbumininTBSbuffertofinalvolume0.5L,keepat4°Ctopreventbacterialcontamination.⑼Developingreagent:1mlchlonoaphtholsolution（30mg/mlinmethanol）,add10mlmethanol,addTBSbufferto50mlandadd30ul30%H2O2.⑽Stainingbuffer:Add1gamidoblack18B（0.1%）,250mlisopropanol（25%）and100mlaceticacid（10%）todistilledwaterwithfinalvolume1L.⑾Destainingbuffer:Add350mlisopropanol（35%）and2mlaceticacid（2%）todistilledwaterwithfinalvolume1L.【Procedure】⒈.SeparationofProteinRunanelectrophoreticseparationofknownantigenicproteins.Themethodofseparationdecidedbythecharactersoftargetprotein,butforsufficientlytransferring,themostcommonmethodisSDS-PAGE.Afterseparation,removeuppersideofsamplewellswitharazorblade.Notchingbottomright-handcornerofgelfororientationandputgelintransferbufferuntilreadytouse.⒉.Electrotransfer⑴PreparationofmembraneCutapieceofPVDFmembrane（MilliporeImmobion-P#IPVH00010）accordingtothesizeofgel.Incubateinmethanolforabout1minonarockeratroomtemp.Removemethanolandequilibratemembranein1xtransferbufferuntilreadytouse.⑵Arrangegel-membranesandwichInashallowtray,openthetransfercassette.Putawell-soakedspongepadontheblackpieceofthetransfercassetteandawetted3MMpaperonthespongepad.Placethegelonthepaperandarrangewellsothatallairbubblesareremoved.LaythePVDFmembraneonthetopofgelandremoveanyairbubbles.Placeawettedsheetof3MMpaperoverthePVDFmembraneandremovethebubble.Coveredwiththesecondwell-soakedpad.Closethesandwichwiththewhitepieceofthecassette.Mountthesandwichinthetransfertank;puttheblacksidesneartheblacksideofthedevice.Fillthebuffertankwiththetransferbuffer.⑶Electrotransfer:Attachtheelectrodes.Setthepowersupplyto100V（constantvoltage）for1hat4°C.⒊.Immunodetection⑴MembranestainingDisconnecttransferapparatus,removetransfercassette,andpeel3MMpaperfrommembrane.Removethemembranetoasmallcontainer.Add10mlTBSbufferandwashforshorttime.Cutoutonestripewith5mmwidthandputinanothercleancontainer.Stainthisstripeinstainingbufferfor1min.Destainfor30minindestainingbuffertocheckwhetherproteinhasbeentransferredfromgeltomembraneornot.⑵MembraneblockingandwashingForotherpartofmembrane,pouroffTBSbuffer.Add3%blockingbuffer，rockgentlyforatleast1h.Pouroff3%blockingbufferandrinsebrieflywithTBSbufferthreetimes,5minutesforpertime.⑶FirstantibodyPouroffTBSbuffer.Addfirstantibodyatappropriatedilutionin10ml0.5%blockingbuffer.Rockgentlyforatleast1h;pourofffirstantibodysolutionfrommembraneandwashtwicefor10minuteswithTTBSbuffer.⑷SecondantibodyPouroffTTBSbuffer.Addsecondantibodyatappropriatedilutionin5ml0.5%blockingbuffer.Rockgentlyfor30min,pouroffsecondantibodysolutionfrommembraneandwashtwicefor10minuteswithTTBSbuffer.⑸DetectionPouroffTTBSbufferfrommembraneandadddevelopingreagent,RockPVDFgently,monitoringdevelopment.Whenthebandscanbeseenclearly,stopdevelopmentbywashingmembranewithdistilledwaterfor30minuteswith3changes.【Result】Checkthebandsonmembrane,thebandwithblue-purplecolorcorrespondingtothetargetprotein.實驗材料】1.實驗器材SDS/PAGE實驗相關(guān)材料；電轉(zhuǎn)移裝置；供電設(shè)備；PVDF膜（MilliporeImmobion-P#IPVH00010）；Whatman3MM紙；其他工具：鑷子、海綿墊、剪子、手套、小塑料或玻璃容器、淺盤。Detection2.實驗試劑⑴10x轉(zhuǎn)移緩沖溶液（1L）：30.3gTrizmabase（0.25M）,144g甘氨酸（1.92M）,加蒸餾水至1L,此時pH約為8.3，不必調(diào)整。⑵1x轉(zhuǎn)移緩沖溶液（2L）：在1.4L蒸餾水中加入400ml甲醇及200ml10x轉(zhuǎn)移緩沖溶液。⑶TBS緩沖溶液:將1.22gTris（10mM）和8.78gNaCl（150mM）加入到1L蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)pH至7.5。⑷TTBSbuffer：在1LTBS緩沖溶液中加入0.5mlTween20（0.05%）。⑸一抗：兔抗待測蛋白抗體（多克隆抗體）。（6）二抗：辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔。⑺3%封阻緩沖溶液（0.5L）：牛血清白蛋白15mg加入TBS緩沖溶液并定容至0.5L，過濾，在4°C保存以防止細菌污染。⑻0.5%封阻緩沖溶液（0.5L）：牛血清白蛋白2.5mg加入TTBS緩沖溶液并定容至0.5L，過濾，在4°C保存以防止細菌污染。⑼顯影試劑：1ml氯萘溶液（30mg/ml甲醇配置），加入10ml甲醇，加入TBS緩沖溶液至50ml，加入30ul30%H2O2。⑽染色液：1g氨基黑18B（0.1%），250ml異丙醇（25%）及100ml乙酸（10%）用蒸餾水定容至1L。⑾脫色液：將350ml異丙醇（35%）和20ml乙酸（2%）用蒸餾水定容至1L。[詳細]

  2018-09-27 10:01

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