冷凍干燥技術(shù)是將含水物料預(yù)先凍結(jié)后在真空狀態(tài)下進行升華而獲得干燥物料的方法，干燥后物料原有的化學(xué)、生物特性基本不變，易于長期保存，是一種優(yōu)良的干燥方法，被廣泛應(yīng)用于食品、生物制品、醫(yī)藥、化工、材料制備等各個領(lǐng)域。而在冷凍干燥過程中，物料的共晶點和共熔點是凍干工藝中重要的2個參數(shù)。物料的共晶點是指物料中的水分全部凍結(jié)時的溫度。物料的共熔點是指完全凍結(jié)的物料，當(dāng)溫度升至某一值時，物料內(nèi)部的冰晶開始熔化時的溫度。由于冷凍干燥是在真空狀態(tài)下進行，只有產(chǎn)品全部凍結(jié)后才能在真空下進行升華，否則有部分液體存在時，在真空下不僅會迅速蒸發(fā)，造成凍干產(chǎn)品鼓泡，因此凍干產(chǎn)品升華時物料預(yù)凍溫度要低于物料共晶點5～10℃，保證物料完全凍結(jié)，同時在干燥時加熱溫度不能高于物料的共熔點，否則在物料內(nèi)部將會產(chǎn)生氣泡或充氣膨脹，出現(xiàn)融化和干縮現(xiàn)象，影響凍干制品的質(zhì)量。

北京四環(huán)福瑞凍干技術(shù)適用于液態(tài)物料的共晶點和共熔點測試。

一、共熔點測試

需要凍干的產(chǎn)品，一般是預(yù)先配制成水的溶液或懸濁液，因此它的冰點與水就不相同了，水在0℃時結(jié)冰，而海水卻要在低于0℃的溫度才結(jié)冰，因為海水也是多種物質(zhì)的水溶液。實驗指出溶液的冰點將低于溶媒的冰點。
   另外，溶液的結(jié)冰過程與純液體也不一樣，純液體如水在0℃時結(jié)冰，水的溫度并不下降，直到全部水結(jié)冰之后溫度才下降，這說明純液體有一個固定的結(jié)冰點。而溶液卻不一樣，它不是在某一固定溫度完全凝結(jié)成固體，而是在某一溫度時，晶體開始析出，隨著溫度的下降，晶體的數(shù)量不斷增加，直到Z后，溶液才全部凝結(jié)。這樣，溶液并不是在某一固定溫度時凝結(jié)。而是在某一溫度范圍內(nèi)凝結(jié)，當(dāng)冷卻時開始析出晶體的溫度稱為溶液的冰點。而溶液全部凝結(jié)的溫度叫做溶液的凝固點。因為凝固點就是融化的開始點（既熔點），對于溶液來說也就是溶質(zhì)和溶媒共同熔化的點，所以又叫做共熔點。共熔點才是溶液真正全部凝成固體的溫度。
    共熔點的概念對于冷凍干燥是重要的，因為凍干產(chǎn)品可能有鹽類、糖類、明膠、蛋白質(zhì)、血球、組織、病毒、細(xì)菌等等的物質(zhì)。由于冷凍干燥是在真空狀態(tài)下進行，只有產(chǎn)品全部凍結(jié)后才能在真空下進行升華，否則有部分液體存在時，在真空下不僅會迅速蒸發(fā)，造成液體的濃縮使凍干產(chǎn)品的體積縮??；而且溶解在水中的氣體在真空下會迅速冒出來，造成象液體沸騰的樣子，使凍干產(chǎn)品鼓泡，甚至冒出瓶外。為此凍干產(chǎn)品在升華開始時必須要冷到共熔點以下的溫度，使凍干產(chǎn)品真正全部凍結(jié)。
二、共晶點測試

共晶點是指物料中水分完全凍結(jié)成冰晶時的溫度。在升華過程中，物料溫度應(yīng)維持在低于而又接近共融點的溫度。也指物料中游離水分完全凍結(jié)成冰晶時的溫度。在溶液的凍干過程中，非常有必要知道溶液的共晶點，因為這將有助于控制預(yù)凍和升華過程。在真空冷凍干燥過程中Z關(guān)鍵的條件就是控制物料溫度保持在共晶點溫度以下10-15℃，從而保證物料不熔化，維持微孔結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)保持完好不變。

在凍干過程中，物料預(yù)凍的Z終溫度以其共晶點為依據(jù)，干燥加熱時物料的溫度以其共熔點為依據(jù)。物料的共晶點是指物料中的水分全部凍結(jié)時的溫度。為保證物料完全凍結(jié)，預(yù)凍溫度要比物料的共晶點低5-10℃。若預(yù)凍溫度過低，則增加能耗和生產(chǎn)成本；若預(yù)凍溫度高于共晶點，則不能保證物料中的水分完全凍結(jié)，物料內(nèi)部水分將不能完全以冰的形式升華，導(dǎo)致物料在干燥過程中發(fā)生收縮和失形等問題。另外，未凍結(jié)的水分中所含溶質(zhì)，在干燥過程中可能隨內(nèi)部水分向物料表面遷移，出現(xiàn)凍干制品表面硬化現(xiàn)象。物料共熔點是指完全凍結(jié)的物料，當(dāng)溫度升至某一值時，物料內(nèi)部的冰晶開始熔化時的溫度。干燥時加熱溫度不能高于物料的共熔點，否則在物料內(nèi)部將會產(chǎn)生氣泡或充氣膨脹，影響凍干制品的質(zhì)量。

常規(guī)測定共晶點/共熔點的方法是電阻法，故準(zhǔn)確地測定物料的共晶點與共熔點，對冷凍干燥工藝的制定和凍干過程的優(yōu)化控制就顯得尤為重要。

三、測試儀的主要特點

1. 智能化自動判斷物料共晶點和共熔點。

2. 采用兩行式液晶顯示屏，直接顯示物料的共晶點和共熔點。

3. 實時顯示當(dāng)前物料溫度。

4. 性能穩(wěn)定、可靠，操作簡單。

四、使用條件

1. 正常工作條件：環(huán)境溫度：5℃～30℃

相對濕度≤85%

電源電壓：AC（220V±22）V  （50±1）Hz

工作環(huán)境應(yīng)通風(fēng)良好，沒有導(dǎo)電塵埃、爆炸性、腐蝕性氣體及強電磁場干擾。

2. 運輸貯存條件：環(huán)境溫度：≤30℃

相對濕度：≤85%

貯存環(huán)境應(yīng)通風(fēng)良好，無腐蝕性氣體。

五、操作步驟

1、共熔點測量法

1）將一對白金電極浸入液體產(chǎn)品之中，并在產(chǎn)品中插一溫度計，把它們冷卻到-40℃以下的低溫，然后將凍結(jié)產(chǎn)品慢慢升溫。

2）用惠斯頓電橋來測量其電阻，當(dāng)發(fā)生電阻突然降低時，這時的溫度即為產(chǎn)品的共熔點。電橋要用交流電供電，因為直流電會發(fā)生電解作用，整個過程由儀表記錄。

2、共晶點測試儀測量方法

1）將待測試的物料裝入西林瓶中，調(diào)節(jié)支架高度，使共晶點測試儀的探頭能浸入物料液面下，再鎖緊調(diào)節(jié)螺釘。

2）將測試儀探頭、支架以及裝有物料的西林瓶放入凍干機內(nèi)，關(guān)閉凍干機門。

3）將共晶點測試儀的電源插頭連接上220V交流電源插座中。

4）打開電源開關(guān)，共晶點測試儀即自動進入共晶點共熔點測定程序。此時開啟凍干機進行相應(yīng)冷凍與加熱操作即可。

需要凍干的產(chǎn)品，一般是預(yù)先配制成水的溶液或懸濁液，因此它的冰點與水就不相同了，水在0℃時結(jié)冰，而海水卻要在低于0℃的溫度才結(jié)冰，因為海水也是多種物質(zhì)的水溶液。實驗指出溶液的冰點將低于溶媒的冰點。
      另外，溶液的結(jié)冰過程與純液體也不一樣，純液體如水在0℃時結(jié)冰，水的溫度并不下降，直到全部水結(jié)冰之后溫度才下降，這說明純液體有一個固定的結(jié)冰點。而溶液卻不一樣，它不是在某一固定溫度完全凝結(jié)成固體，而是在某一溫度時，晶體開始析出，隨著溫度的下降，晶體的數(shù)量不斷增加，直到Z后，溶液才全部凝結(jié)。這樣，溶液并不是在某一固定溫度時凝結(jié)。而是在某一溫度范圍內(nèi)凝結(jié)，當(dāng)冷卻時開始析出晶體的溫度稱為溶液的冰點。而溶液全部凝結(jié)的溫度叫做溶液的凝固點。因為凝固點就是融化的開始點（既熔點），對于溶液來說也就是溶質(zhì)和溶媒共同熔化的點。所以又叫做共熔點?？梢娙芤旱谋c與共熔點是不相同的。共熔點才是溶液真正全部凝成固體的溫度。
       顯然共熔點的概念對于冷凍干燥是重要的，因為凍干產(chǎn)品可能有鹽類、糖類、明膠、蛋白質(zhì)、血球、組織、病毒、細(xì)菌等等的物質(zhì)。因此它是一個復(fù)雜的液體，它的凍結(jié)過程肯定也是一個復(fù)雜的過程，與溶液相似，也有一個真正全部凝結(jié)成固體的溫度。即共熔點。由于冷凍干燥是在真空狀態(tài)下進行。只有產(chǎn)品全部凍結(jié)后才能在真空下進行升華，否則有部分液體存在時，在真空下不僅會迅速蒸發(fā)，造成液體的濃縮使凍干產(chǎn)品的體積縮?。欢胰芙庠谒械臍怏w在真空下會迅速冒出來，造成象液體沸騰的樣子，使凍干產(chǎn)品鼓泡，甚至冒出瓶外。這是我們所不希望的。為此凍干產(chǎn)品在升華開始時必須要冷到共熔點以下的溫度，使凍干產(chǎn)品真正全部凍結(jié)。
      在凍結(jié)過程中，從外表的觀察來確定產(chǎn)品是否完全凍結(jié)成固體是不可能的；靠測量溫度也無法確定產(chǎn)品內(nèi)部的結(jié)構(gòu)狀態(tài)。而隨著產(chǎn)品結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時電性能的變化是極為有用的，特別是在凍結(jié)是電阻率的測量能使我們知道凍結(jié)是在進行還是已經(jīng)完成了，全部凍結(jié)后電阻率將非常大，因此溶液是離子導(dǎo)電。凍結(jié)是離子將固定不能運動，因此電阻率明顯增大。而有少量液體存在時電阻率將顯著下降。因此測量產(chǎn)品的電阻率將能確定產(chǎn)品的共熔點。
       正規(guī)的共熔點測量法是將一對白金電極浸入液體產(chǎn)品之中，并在產(chǎn)品中插一溫度計，把它們冷卻到-40℃以下的低溫，然后將凍結(jié)產(chǎn)品慢慢升溫。用惠斯頓電橋來測量其電阻，當(dāng)發(fā)生電阻突然降低時，這時的溫度即為產(chǎn)品的共熔點。電橋要用交流電供電，因為直流電會發(fā)生電解作用，整個過程由儀表記錄。
      也可用簡單的方法來測量，用二根適當(dāng)粗細(xì)而又互相絕緣的銅絲插入盛放產(chǎn)品的容器中，作為電極。在銅電極附近插入一支溫度計，插入深度與電極差不多，把它們一起放入凍干箱內(nèi)的觀察窗孔附近，并用適當(dāng)方法把它們固定好，然后與其它產(chǎn)品一起預(yù)凍，這時我們用萬用表不斷地測量在降溫過程中的電阻數(shù)值，根據(jù)電阻數(shù)值的變化來確定共熔點。
      把電極引線通過一個開關(guān)與萬用表相連，可以不分正負(fù)極。如果凍干箱沒有電線引出接頭，則可以用二根細(xì)導(dǎo)線從箱門縫處引出，在電線附近涂些真空密封蠟，這樣不致于影響真空度。
      待溫度計降至0℃之后即開始測量并作記錄。把萬用表的轉(zhuǎn)換開關(guān)放在測量電阻的Z（×1K或×10K）。由于萬用表內(nèi)使用的是直流電，為了防止電解作用，在每次測量完之后要把開關(guān)立即關(guān)掉，把每一次測量的溫度和電阻數(shù)值一一記錄下來。開始時電阻值很小，以后逐步。到某一溫度時電阻突然增大，幾乎是無窮大，這時的溫度值便是共熔點數(shù)值。

      用這種方法測量的共熔點有一定的誤差，因為銅電極處多少有些電解作用。萬用表對于高阻值沒有電橋靈敏；另外，凍結(jié)過程與熔化過程電阻的變化情況并不完全相同，但所測之值仍有實用參考價值。

（來源：四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展(北京)有限公司）

四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展（北京）有限公司

共晶點測試儀使用說明書

冷凍干燥技術(shù)是將含水物料預(yù)先凍結(jié)后在真空狀態(tài)下進行升華而獲得干燥物料的方法，干燥后物料原有的化學(xué)、生物特性基本不變，易于長期保存，是一種優(yōu)良的干燥方法，被廣泛應(yīng)用于食品、生物制品、醫(yī)藥、化工、材料制備等各個領(lǐng)域。而在冷凍干燥過程中，物料的共晶點和共熔點是凍干工藝中最為重要的2個參數(shù)。物料的共晶點是指物料中的水分全部凍結(jié)時的溫度。物料的共熔點是指完全凍結(jié)的物料，當(dāng)溫度升至某一值時，物料內(nèi)部的冰晶開始熔化時的溫度。由于冷凍干燥是在真空狀態(tài)下進行，只有產(chǎn)品全部凍結(jié)后才能在真空下進行升華，否則有部分液體存在時，在真空下不僅會迅速蒸發(fā)，造成凍干產(chǎn)品鼓泡，因此凍干產(chǎn)品升華時物料預(yù)凍溫度要低于物料共晶點5～10℃，保證物料完全凍結(jié)，同時在干燥時加熱溫度不能高于物料的共熔點，否則在物料內(nèi)部將會產(chǎn)生氣泡或充氣膨脹，出現(xiàn)融化和干縮現(xiàn)象，影響凍干制品的質(zhì)量。

本儀器適用于液態(tài)物料的共晶點和共熔點測試。

一、主要特點：

1. 智能化自動判斷物料共晶點和共熔點。

2. 采用兩行式液晶顯示屏，直接顯示物料的共晶點和共熔點。

3. 實時顯示當(dāng)前物料溫度。

4. 性能穩(wěn)定、可靠，操作簡單。

二、使用條件

1. 正常工作條件：環(huán)境溫度：5℃～30℃

相對濕度≤85%

電源電壓：AC（220V±22）V  （50±1）Hz

工作環(huán)境應(yīng)通風(fēng)良好，沒有導(dǎo)電塵埃、爆炸性、腐蝕性氣體及強電磁場干擾。

2. 運輸貯存條件：環(huán)境溫度：≤30℃

相對濕度：≤85%

貯存環(huán)境應(yīng)通風(fēng)良好，無腐蝕性氣體。

三、系統(tǒng)構(gòu)成

共晶點測試儀的實物外觀如圖1所示，測量探頭及其支座如圖2所示。

圖1 共晶點測試儀的實物圖

圖2 共晶點測試儀探頭示意圖

1. 電源插座及開關(guān)

為共晶點測試儀的電源線接口及開關(guān)，打到“開”位置，系統(tǒng)上電，即開始正常工作，隨著物料的冷凍或升溫測試儀自動測量判斷共晶點或共融點；打到“關(guān)”位置，系統(tǒng)掉電，設(shè)備停止運行。

2. LCD顯示屏

LCD顯示屏實時顯示物料的當(dāng)前溫度以及共晶點和共熔點。其顯示的Tnow為溫度探頭測量得到的當(dāng)前溫度，第二行顯示的為測量得到的共晶點和共熔點，其中Tj為共晶點，Tr為共熔點，單位均為℃。

3. 測量探頭及支座

共晶點測試儀的溫度探頭采用加長的Pt1000溫度探頭，阻抗探頭采用特殊定制的不銹鋼探針。為了實現(xiàn)探頭的固定以及確保其相對位置，探頭支座采用聚四氟乙烯材料加工裝配而成，探頭測量高度可通過高度調(diào)節(jié)旋鈕進行調(diào)節(jié)，以適應(yīng)不同高度的西林瓶和物料液面。

4. 探頭接口

用于測量探頭與測試儀主體連接，開始測量前，請確保探頭插頭與測試儀主體可靠對接。

四、操作步驟

1. 將待測試的物料裝入西林瓶中，調(diào)節(jié)支架高度，使共晶點測試儀的探頭能浸入物料液面下，再鎖緊調(diào)節(jié)螺釘。

2. 將測試儀探頭、支架以及裝有物料的西林瓶放入凍干機內(nèi)，關(guān)閉凍干機門。

3. 將共晶點測試儀的電源插頭連接上220V交流電源插座中。

4. 打開電源開關(guān)，共晶點測試儀即自動進入共晶點共熔點測定程序。此時開啟凍干機進行相應(yīng)冷凍與加熱操作即可。

五、注意事項

1. 請按規(guī)程先放置好待測物料后再打開測試儀開關(guān)。

2. 本系統(tǒng)的實時溫度顯示在+100℃及以上只顯示“+HH.H℃”，-100℃及以下顯示-LL.L℃，在-100℃至+100℃之間顯示實際溫度。系統(tǒng)在未測得共晶點或共熔點時，共晶點和共熔點溫度顯示為Tj=*****Tr=*****。

3. 測試儀內(nèi)部電源為AC220V電源，非專業(yè)人員不要打開測試儀外殼，以免發(fā)生電擊危險。

4. 請妥善保管測量探頭及支座，不要對探頭進行彎折或拆卸，以免造成不必要的損壞。

六、可能出現(xiàn)的故障及排除方法

可能出現(xiàn)的故障見表1。

表1 可能出現(xiàn)的故障及排除方法

對本機可能出現(xiàn)的任何故障，我公司均提供技術(shù)咨詢和服務(wù)，必要時派專業(yè)維修人員上門處置。

本機自用戶購買之日起，保修期限為一年。在此期限內(nèi)，正確操作使用過程中發(fā)生機器故障，由我公司無償提供各種技術(shù)服務(wù)；超過此期限，我公司可提供免費技術(shù)咨詢和有償維修服務(wù)，費用由我公司售后服務(wù)部門與用戶商定。

前言

冷凍干燥工藝三個步驟：

預(yù)凍

—次干燥

二次干燥

其中預(yù)凍階段除了將液體凍結(jié)為固體，還有將溶質(zhì)與溶液通過相變進行分離的作用，因此一個好的預(yù)凍工藝不僅決定了后續(xù)步驟中干燥的效率，也會影響產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（如：產(chǎn)品的水分，復(fù)溶速率等）。而在預(yù)凍工藝的設(shè)計中，退火是優(yōu)化凍干工藝非常重要的一個手段。

預(yù)凍過程介紹

在退火程序開始前，溶液已經(jīng)經(jīng)歷了一次預(yù)凍過程被凍結(jié)成固體，此時固體的組成對研究退火工藝至關(guān)重要?？梢酝ㄟ^二元相圖進行簡要的描述預(yù)凍過程。

階段一：

(A→B→C→D)溶液從室溫A開始降溫，到達冰點B，由于無晶核存在，不發(fā)生結(jié)晶，從而形成過冷溶液，當(dāng)?shù)竭_C點時，形成晶核，發(fā)生結(jié)晶，整個溶液溫度會回到冰點D點讓水繼續(xù)結(jié)晶。

階段二：

(D→Te)隨著水結(jié)晶增多，未凍結(jié)相溶質(zhì)濃度增大，當(dāng)?shù)竭_共晶點Te時，理論上會形成共晶體，但是實際上會有部分溶液無法形成共晶（根據(jù)溶質(zhì)性質(zhì)，形成共晶的比例會不同)

階段三：

(Te→E→Tg’）非晶態(tài)溶液繼續(xù)降溫形成過飽和溶液，最終在Tg’點完全固化，形成玻璃體，同時玻璃體中也會包含部分未來得及結(jié)晶的水分子即結(jié)合水。

階段四:

(Tg’→F）進一步降溫，這時結(jié)晶相和非晶相比例不會改變，此時形成了一個即有水的冰晶，共晶體，玻璃體的混合物。

以上的四個階段都是理想的狀況，而實際的預(yù)凍過程會更加復(fù)雜，預(yù)凍速率的加快會加重這種復(fù)雜程度，首先有部分水分子沒有來得及按照理想狀況形成晶格，而被包裹進非晶相溶液中；其次結(jié)晶快速生長會將非均相溶液分散隔絕開，不同區(qū)域內(nèi)溶質(zhì)濃度、性質(zhì)區(qū)別也很大，如表面富集現(xiàn)象。

退火的原理

退火程序是將已凍結(jié)樣品由溫度F點升高到一定溫度維持，再降低到F點凍結(jié)的過程。

從動力學(xué)角度來看，退火過程遵循吉布斯-居里-烏洛普的表面能理論：晶體的平衡形狀應(yīng)該是使晶體單位體積具有最小的總表面積自由能，簡單來說就是表面積；體積比值趨向于最小化，即小的體積變成大體積，片狀變成球狀或圓柱狀。

從熱力學(xué)角度來看，退火過程中存在兩個變化，非晶態(tài)物質(zhì)在高于Tg’時粘度會隨溫度升高而降低，從而發(fā)生流動、聚合；晶態(tài)的物質(zhì)，小的冰晶分子會向大的冰晶遷移。

四環(huán)凍干機

四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展（北京）有限公司法人由原北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有 限公司技術(shù)研發(fā)和管理負(fù)責(zé)人擔(dān)任，是為客戶提供專業(yè)真空冷凍干燥設(shè)備及解 決方案的服務(wù)供應(yīng)商。我們秉承“以客戶為中心，追求最高的客戶滿意度”的 服務(wù)理念，個性服務(wù)、創(chuàng)新設(shè)計、高效處理、可靠保障，可根據(jù)用戶需求提供 和設(shè)計單個或多個符合 GMP 相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的凍干設(shè)備配套系統(tǒng)，如負(fù)壓和無菌隔 離器、自動進出料及外置 CIP 等系統(tǒng)。 

我們以共贏發(fā)展為本，技術(shù)服務(wù)為根，在臻于完善中與眾不同，在持續(xù)發(fā) 展中追求卓越。

5.2.2 乳酸菌菌種凍干

能從葡萄糖或乳糖的發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌統(tǒng)稱為乳酸菌，共有200多種。目前已被國內(nèi)外生物學(xué)家所證實，腸內(nèi)乳酸菌與健康長壽有著非常密切的直接關(guān)系。乳酸菌種在酸奶生產(chǎn)中是非常關(guān)鍵的物質(zhì)，可以利用乳酸菌提高釀造和發(fā)酵食品的風(fēng)味。乳酸菌凍干是將菌種速凍，然后在真空條件下升華，可以保持菌種的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)。凍干后，菌種酶化作用減弱，生物活性不變，常溫下可貯存3～5年。加水后極易復(fù)原，復(fù)水率達90%以上。冷凍真空干燥乳酸菌發(fā)酵劑，具有活力強、用量少、污染低、品種多、方便儲運等特點，已在歐美等發(fā)達國家得到廣泛應(yīng)用。

影響乳酸菌凍干效果的因素包括菌株、細(xì)胞大小形狀、初始細(xì)胞濃度、降溫速率、pH值、保護劑、預(yù)凍溫度、干燥條件、復(fù)水條件等，其中凍干保護劑系統(tǒng)的影響較突出。研究表明，乳酸菌凍干前加入適當(dāng)?shù)谋Ｗo劑，可影響乳酸菌在凍干過程中的細(xì)胞存活率和保藏期間的細(xì)胞穩(wěn)定性。乳酸菌凍干保護劑的保護效果與其化學(xué)結(jié)構(gòu)有著密切的關(guān)系，其特征是具備三個以上的氫鍵，而且具有以適當(dāng)方式存在的游離基團。

5.2.2.1預(yù)凍方式對乳酸菌菌種凍干的影響

朱東升研究了預(yù)凍方式對凍干乳酸菌菌種活菌數(shù)的影響。實驗中分別研究了嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌采用慢凍和液氮快凍后，凍干菌種活菌數(shù)與預(yù)凍方式的關(guān)系。具體實驗方案為：將菌懸液盛入冷凍平皿中，將其先置4℃冰箱平衡30min后，移入-30℃冰箱60min,然后置-80℃冰箱60min,進行普通預(yù)凍，再在冷凍真空千燥機上冷凍千燥12h,密封保存于4℃冰箱中。其余菌懸液先置于冰箱保存30min后，用5mL、1mL、200uL、100uL槍頭滴定于盛有液氮的冷凍平皿中10min,再在冷凍真空干燥機上冷凍干燥12h,密封保存于4℃冰箱中。實驗設(shè)計冷凍真空干燥條件為：凍干室溫度為-60～70℃，

壓力為6mPa。

研究結(jié)果表明，三種菌種用液氮快凍都比普通慢凍存活率高，如圖5-3所示。分析原因為，液氮預(yù)凍的速度比普通預(yù)凍的速度快很多，這樣可以使細(xì)胞內(nèi)部的水滲出到細(xì)胞外面，而水在細(xì)胞內(nèi)部凝結(jié)正是細(xì)胞死亡的致命原因。此外，同樣是用液  氯快凍，菌種液滴大小不同，其活菌數(shù)也不同，液滴小者活菌數(shù)高。當(dāng)一定體積的菌液，由不同大小的液滴進行滴定，隨總表面積增大，其存活率也增大。因為單位體積的菌液，其總表面積增大以后，水分的滲出速度也加快，所以存活率可以提高。

5.2.2.2冷凍干燥保護劑對乳桿菌凍干的影響

劉丹等研究了瑞士乳桿菌的凍干。將經(jīng)過脫脂乳活化、培養(yǎng)基擴培并離心收集的瑞士乳桿菌菌泥與配制好的保護劑按1：1的比例混合，確定凍干前的活菌數(shù)后，注入凍干管中。凍干管在-75℃預(yù)凍2h,然后在60～120Pa下冷凍干燥32h，干燥后取出在4℃下保藏。用無菌生理鹽水使凍干菌復(fù)水，確定凍干后活菌數(shù)，計算活菌率。實驗研究中分別使用了單一保護劑和復(fù)合保護劑，實驗結(jié)果列于表5-4和表5-5。

表5-4的數(shù)據(jù)表明，與對照組相比，加入保護劑后乳酸菌的存活率均有不同程度的提高，可見所選保護劑對乳酸菌都有一定的保護作用。其中以海藻糖的效果最為顯著。與其他糖類相比，海藻糖的玻璃化相變溫度高，更容易以玻璃態(tài)存在，對生物材料的穩(wěn)定有很重要的意義。另外，生物體中的大分子均處于一層水膜包圍保護中，這層水膜是維持其結(jié)構(gòu)和功能必不可少的物質(zhì)。干燥時水膜被除去，可導(dǎo)致這些大分子物質(zhì)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的變化。若有海藻糖做保護劑，海藻糖可在生物分子的失水部位與這些分子形成氫鍵，使其在缺水條件下仍能保持其原有結(jié)構(gòu)，保持活性。表5-5中的數(shù)據(jù)表明，與單一保護劑相比，使用復(fù)合保護劑凍干乳酸菌存活率更高。實驗數(shù)據(jù)還表明，保護劑中海藻糖的在10.4%左右時效果更好，海藻糖濃度過高可能會抑制菌的生長。經(jīng)過優(yōu)化，最  佳的復(fù)合保護劑配比為10.4%海藻糖、11.2%脫脂乳和4%谷氨酸鈉。

5.5.3 凍結(jié)角膜的干燥過程

角膜干燥前，先開啟制冷機，分別對凍干室、捕集器制冷，當(dāng)凍干室內(nèi)溫度降到-20℃以下，捕集器內(nèi)的溫度降到-35℃時，迅速地把經(jīng)過梯度降溫的角膜放到凍干室，立即啟動真空泵。在干燥過程中根據(jù)需要，調(diào)節(jié)充氣閥，向凍干室內(nèi)充入氯氣以調(diào)節(jié)凍干室內(nèi)的壓力，同時根據(jù)需要調(diào)節(jié)制冷閥保證角膜凍干過程中所需要的熱量供給，在干燥初期，不需開啟加熱器，此階段角膜干燥所需要的熱量靠外部傳入即可得到滿足，當(dāng)凍干室內(nèi)溫度達到0℃時，開啟加熱器供給熱量，但保證凍干室的溫度不超過9℃，凍干結(jié)束，關(guān)閉真空泵，對凍干角膜進行充氮包裝。實驗中發(fā)現(xiàn)，角膜在磨口玻璃瓶中的放置方式（圖5-14）對凍干角膜質(zhì)量有一定的影響，試驗表明，角膜懸于磨口玻璃瓶中，內(nèi)皮細(xì)胞層朝下為最佳放置方式。如圖5-14(b)所示。

角膜凍干過程熱量的供給很容易滿足，整個凍干過程可以視為傳質(zhì)控制過程，傳質(zhì)速率由細(xì)胞膜固有通導(dǎo)能力決定。干燥過程中，應(yīng)根據(jù)干燥的不同程度，來確定凍干室內(nèi)壓力的高低以及所持續(xù)的時間，保證水蒸氣由細(xì)胞膜孔隙溢出，且細(xì)胞膜內(nèi)外壓差始終很小，以減小對細(xì)胞的傷害。

由于角膜細(xì)胞很脆弱，在凍干過程中極易受到干燥應(yīng)力、機械應(yīng)力的損傷，凍干過程中低壓時間過長或細(xì)胞膜內(nèi)外壓差過大，都會大大降低凍干角膜的成活率。變幅值、變周期的循環(huán)壓力法應(yīng)用于角膜的凍干，有利于角膜活性的提高。其根本原因是在整個干燥過程中，角膜細(xì)胞內(nèi)外壓差小，對角膜的損傷小。這主要源于兩方面原因：一是通過控制凍干室內(nèi)真空度的高低，以及循環(huán)時間的長短，使細(xì)胞內(nèi)的蒸汽及時擴散到凍干室中，避免了細(xì)胞內(nèi)飽和蒸氣壓過高，膜內(nèi)外壓差過大，造成細(xì)胞的損傷。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)蒸氣壓較高時，開啟充氣閥向凍干室內(nèi)充入氮氣，在細(xì)胞膜外施加一壓力，雖然此時傳入細(xì)胞內(nèi)的熱量增多，使細(xì)胞內(nèi)的蒸氣壓進一步升高，但此蒸氣壓的升高較細(xì)胞膜外壓力的升高小得多，結(jié)果是細(xì)胞膜內(nèi)外的凈壓差減小。然后，漸漸關(guān)閉充氣閥，使凍于室內(nèi)的真空度逐漸升高，這樣角膜細(xì)胞內(nèi)的蒸汽較平緩的通過細(xì)胞膜擴散到凍干室，減小了壓差對細(xì)胞膜的損傷。當(dāng)凍干室內(nèi)真空度升高到一定程度，再逐漸充入氨氣，傳人的熱量增多，開始了下一個周期。二是強化傳熱并促進外部傳質(zhì)，縮短凍干時間，從而減少了角膜內(nèi)皮細(xì)胞受干燥應(yīng)力損傷程度，具體工藝是讀干室內(nèi)溫度到-25℃，真空度為50Pa時，開始第-次循環(huán)，溫度每升高5℃循環(huán)一次，循環(huán)5個周期，溫度達到0℃時，循環(huán)停止。壓力時間關(guān)系曲線見圖5-15，角腹的凍干工藝曲線如圖5-16所示。

圖5-17、圖5-18分別為按上述工藝凍干角膜透射電鏡檢測結(jié)果、掃描電鏡檢測結(jié)果。從圖5-17、圖5-18可以看出，凍干角膜的內(nèi)皮細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞輪廓接近于六邊形。

細(xì)胞膜完整，細(xì)胞核膜完整，內(nèi)皮細(xì)胞層與后彈力層連接緊密。這是因為整個凍干過程中，根據(jù)干燥的不同程度，來確定高室壓、低室壓以及所持續(xù)的時間，保證了水蒸氣由細(xì)胞膜的孔隙溢出，即傳質(zhì)速率由細(xì)胞膜的固有通導(dǎo)能力決定，保證了細(xì)胞內(nèi)外壓差始終很小，減小了對細(xì)胞的傷害。

需要凍干的產(chǎn)品，一般是預(yù)先配制成水的溶液或懸濁液，因此它的冰點與水就不相同了，水在0℃時結(jié)冰，而海水卻要在低于0℃的溫度才能結(jié)冰，因為海水也是多種物質(zhì)的水溶液。實驗指出，溶液的冰點將低于溶媒的冰點。

另外，溶液的結(jié)冰過程與純液體也不一樣，純液體如水在0℃時結(jié)冰，水的溫度并不下降，直到全部水結(jié)冰之后溫度才下降，這說明純液體有一個固定的結(jié)冰點。而溶液卻不一樣，它不是在某一固定溫度完全凝結(jié)成固體，而是在某一溫度時，晶體開始析出，隨著溫度的下降，晶體的數(shù)量不斷增加，直到最后，溶液才全部凝結(jié)。這樣，溶液并不是在某一固定溫度時凝結(jié)。而是在某一溫度范圍內(nèi)凝結(jié)。當(dāng)冷卻時開始析出晶體的溫度稱為溶液的冰點。而溶液全部凝結(jié)的溫度叫做溶液的凝固點。凝固點就是融化的開始點（即熔點），對于溶液來說也就是溶質(zhì)和溶媒共同熔化的點。所以又叫做共熔點或共晶點?？梢娙芤旱谋c與共熔點是不相同的。共熔點才是溶液真正全部凝成固體的溫度。

顯然共熔點的概念對于冷凍干燥是重要的。因為凍干產(chǎn)品可能有鹽類、糖類、明膠、蛋白質(zhì)、血球、組織、病毒、細(xì)菌等等的物質(zhì)。因此它是一個復(fù)雜的液體，它的凍結(jié)過程肯定也是一個復(fù)雜的過程，與溶液相似，也有一個真正全部凝結(jié)成固體的溫度，即共熔點。由于冷凍干燥是在真空狀態(tài)下進行的。只有產(chǎn)品全部凍結(jié)后才能在真空下進行升華干燥，否則有部分液體存在時，在真空下不僅會迅速蒸發(fā)，造成液體的濃縮使凍干產(chǎn)品的體積縮??；而且溶解在水中的氣體在真空下會迅速冒出來，造成象液體沸騰的樣子，使凍干產(chǎn)品鼓泡、甚至冒出瓶外。這是我們所不希望的。為此凍干產(chǎn)品在升華開始時必須要制冷到共熔點以下的溫度，使凍干產(chǎn)品真正全部凍結(jié)。

在凍結(jié)過程中，從外表的觀察來確定產(chǎn)品是否完全凍結(jié)成固體是不可能的；靠測量溫度也無法確定產(chǎn)品內(nèi)部的結(jié)構(gòu)狀態(tài)。而隨著產(chǎn)品結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時電性能的變化是極為有用的，特別是在凍結(jié)時電阻率的測量能使我們知道凍結(jié)是在進行還是已經(jīng)完成了，全部凍結(jié)后電阻率將非常大，因此溶液是離子導(dǎo)電。凍結(jié)時離子將固定不能運動，因此電阻率明顯增大。而有少量液體存在時電阻率將顯著下降。因此測量產(chǎn)品的電阻率將能確定產(chǎn)品的共熔點。

正規(guī)的共熔點測量法是將一對白金電極浸入液體產(chǎn)品之中，并在產(chǎn)品中插一支溫度計，把它們冷卻到-40℃以下的低溫，然后將凍結(jié)產(chǎn)品慢慢升溫。用惠斯頓電橋來測量其電阻，當(dāng)發(fā)生電阻突然降低時，這時的溫度即為產(chǎn)品的共熔點。電橋要用交流電供電，因為直流電會發(fā)生電解作用，整個過程由儀表記錄。

也可用簡單的方法來測量，用二根適當(dāng)粗細(xì)而又互相絕緣的銅絲插入盛放產(chǎn)品的容器中，作為電極。在銅電極附近插入一支溫度計，插入深度與電極差不多，把它們一起放入凍干箱內(nèi)的觀察窗孔附近，并用適當(dāng)方法把它們固定好，然后與其他產(chǎn)品一起預(yù)凍，這時我們用萬用表不斷地測量在降溫過程中的電阻數(shù)值，根據(jù)電阻數(shù)值的變化來確定共熔點。

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