5.2.2 乳酸菌菌種凍干

能從葡萄糖或乳糖的發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸的細菌統(tǒng)稱為乳酸菌，共有200多種。目前已被國內(nèi)外生物學家所證實，腸內(nèi)乳酸菌與健康長壽有著非常密切的直接關系。乳酸菌種在酸奶生產(chǎn)中是非常關鍵的物質(zhì)，可以利用乳酸菌提高釀造和發(fā)酵食品的風味。乳酸菌凍干是將菌種速凍，然后在真空條件下升華，可以保持菌種的穩(wěn)定結構和營養(yǎng)。凍干后，菌種酶化作用減弱，生物活性不變，常溫下可貯存3～5年。加水后極易復原，復水率達90%以上。冷凍真空干燥乳酸菌發(fā)酵劑，具有活力強、用量少、污染低、品種多、方便儲運等特點，已在歐美等發(fā)達國家得到廣泛應用。

影響乳酸菌凍干效果的因素包括菌株、細胞大小形狀、初始細胞濃度、降溫速率、pH值、保護劑、預凍溫度、干燥條件、復水條件等，其中凍干保護劑系統(tǒng)的影響較突出。研究表明，乳酸菌凍干前加入適當?shù)谋Ｗo劑，可影響乳酸菌在凍干過程中的細胞存活率和保藏期間的細胞穩(wěn)定性。乳酸菌凍干保護劑的保護效果與其化學結構有著密切的關系，其特征是具備三個以上的氫鍵，而且具有以適當方式存在的游離基團。

5.2.2.1預凍方式對乳酸菌菌種凍干的影響

朱東升研究了預凍方式對凍干乳酸菌菌種活菌數(shù)的影響。實驗中分別研究了嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌采用慢凍和液氮快凍后，凍干菌種活菌數(shù)與預凍方式的關系。具體實驗方案為：將菌懸液盛入冷凍平皿中，將其先置4℃冰箱平衡30min后，移入-30℃冰箱60min,然后置-80℃冰箱60min,進行普通預凍，再在冷凍真空千燥機上冷凍千燥12h,密封保存于4℃冰箱中。其余菌懸液先置于冰箱保存30min后，用5mL、1mL、200uL、100uL槍頭滴定于盛有液氮的冷凍平皿中10min,再在冷凍真空干燥機上冷凍干燥12h,密封保存于4℃冰箱中。實驗設計冷凍真空干燥條件為：凍干室溫度為-60～70℃，

壓力為6mPa。

研究結果表明，三種菌種用液氮快凍都比普通慢凍存活率高，如圖5-3所示。分析原因為，液氮預凍的速度比普通預凍的速度快很多，這樣可以使細胞內(nèi)部的水滲出到細胞外面，而水在細胞內(nèi)部凝結正是細胞死亡的致命原因。此外，同樣是用液  氯快凍，菌種液滴大小不同，其活菌數(shù)也不同，液滴小者活菌數(shù)高。當一定體積的菌液，由不同大小的液滴進行滴定，隨總表面積增大，其存活率也增大。因為單位體積的菌液，其總表面積增大以后，水分的滲出速度也加快，所以存活率可以提高。

5.2.2.2冷凍干燥保護劑對乳桿菌凍干的影響

劉丹等研究了瑞士乳桿菌的凍干。將經(jīng)過脫脂乳活化、培養(yǎng)基擴培并離心收集的瑞士乳桿菌菌泥與配制好的保護劑按1：1的比例混合，確定凍干前的活菌數(shù)后，注入凍干管中。凍干管在-75℃預凍2h,然后在60～120Pa下冷凍干燥32h，干燥后取出在4℃下保藏。用無菌生理鹽水使凍干菌復水，確定凍干后活菌數(shù)，計算活菌率。實驗研究中分別使用了單一保護劑和復合保護劑，實驗結果列于表5-4和表5-5。

表5-4的數(shù)據(jù)表明，與對照組相比，加入保護劑后乳酸菌的存活率均有不同程度的提高，可見所選保護劑對乳酸菌都有一定的保護作用。其中以海藻糖的效果最為顯著。與其他糖類相比，海藻糖的玻璃化相變溫度高，更容易以玻璃態(tài)存在，對生物材料的穩(wěn)定有很重要的意義。另外，生物體中的大分子均處于一層水膜包圍保護中，這層水膜是維持其結構和功能必不可少的物質(zhì)。干燥時水膜被除去，可導致這些大分子物質(zhì)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的變化。若有海藻糖做保護劑，海藻糖可在生物分子的失水部位與這些分子形成氫鍵，使其在缺水條件下仍能保持其原有結構，保持活性。表5-5中的數(shù)據(jù)表明，與單一保護劑相比，使用復合保護劑凍干乳酸菌存活率更高。實驗數(shù)據(jù)還表明，保護劑中海藻糖的在10.4%左右時效果更好，海藻糖濃度過高可能會抑制菌的生長。經(jīng)過優(yōu)化，最  佳的復合保護劑配比為10.4%海藻糖、11.2%脫脂乳和4%谷氨酸鈉。

5.5.3 凍結角膜的干燥過程

角膜干燥前，先開啟制冷機，分別對凍干室、捕集器制冷，當凍干室內(nèi)溫度降到-20℃以下，捕集器內(nèi)的溫度降到-35℃時，迅速地把經(jīng)過梯度降溫的角膜放到凍干室，立即啟動真空泵。在干燥過程中根據(jù)需要，調(diào)節(jié)充氣閥，向凍干室內(nèi)充入氯氣以調(diào)節(jié)凍干室內(nèi)的壓力，同時根據(jù)需要調(diào)節(jié)制冷閥保證角膜凍干過程中所需要的熱量供給，在干燥初期，不需開啟加熱器，此階段角膜干燥所需要的熱量靠外部傳入即可得到滿足，當凍干室內(nèi)溫度達到0℃時，開啟加熱器供給熱量，但保證凍干室的溫度不超過9℃，凍干結束，關閉真空泵，對凍干角膜進行充氮包裝。實驗中發(fā)現(xiàn)，角膜在磨口玻璃瓶中的放置方式（圖5-14）對凍干角膜質(zhì)量有一定的影響，試驗表明，角膜懸于磨口玻璃瓶中，內(nèi)皮細胞層朝下為最佳放置方式。如圖5-14(b)所示。

角膜凍干過程熱量的供給很容易滿足，整個凍干過程可以視為傳質(zhì)控制過程，傳質(zhì)速率由細胞膜固有通導能力決定。干燥過程中，應根據(jù)干燥的不同程度，來確定凍干室內(nèi)壓力的高低以及所持續(xù)的時間，保證水蒸氣由細胞膜孔隙溢出，且細胞膜內(nèi)外壓差始終很小，以減小對細胞的傷害。

由于角膜細胞很脆弱，在凍干過程中極易受到干燥應力、機械應力的損傷，凍干過程中低壓時間過長或細胞膜內(nèi)外壓差過大，都會大大降低凍干角膜的成活率。變幅值、變周期的循環(huán)壓力法應用于角膜的凍干，有利于角膜活性的提高。其根本原因是在整個干燥過程中，角膜細胞內(nèi)外壓差小，對角膜的損傷小。這主要源于兩方面原因：一是通過控制凍干室內(nèi)真空度的高低，以及循環(huán)時間的長短，使細胞內(nèi)的蒸汽及時擴散到凍干室中，避免了細胞內(nèi)飽和蒸氣壓過高，膜內(nèi)外壓差過大，造成細胞的損傷。當細胞內(nèi)蒸氣壓較高時，開啟充氣閥向凍干室內(nèi)充入氮氣，在細胞膜外施加一壓力，雖然此時傳入細胞內(nèi)的熱量增多，使細胞內(nèi)的蒸氣壓進一步升高，但此蒸氣壓的升高較細胞膜外壓力的升高小得多，結果是細胞膜內(nèi)外的凈壓差減小。然后，漸漸關閉充氣閥，使凍于室內(nèi)的真空度逐漸升高，這樣角膜細胞內(nèi)的蒸汽較平緩的通過細胞膜擴散到凍干室，減小了壓差對細胞膜的損傷。當凍干室內(nèi)真空度升高到一定程度，再逐漸充入氨氣，傳人的熱量增多，開始了下一個周期。二是強化傳熱并促進外部傳質(zhì)，縮短凍干時間，從而減少了角膜內(nèi)皮細胞受干燥應力損傷程度，具體工藝是讀干室內(nèi)溫度到-25℃，真空度為50Pa時，開始第-次循環(huán)，溫度每升高5℃循環(huán)一次，循環(huán)5個周期，溫度達到0℃時，循環(huán)停止。壓力時間關系曲線見圖5-15，角腹的凍干工藝曲線如圖5-16所示。

圖5-17、圖5-18分別為按上述工藝凍干角膜透射電鏡檢測結果、掃描電鏡檢測結果。從圖5-17、圖5-18可以看出，凍干角膜的內(nèi)皮細胞間連接緊密，細胞輪廓接近于六邊形。

細胞膜完整，細胞核膜完整，內(nèi)皮細胞層與后彈力層連接緊密。這是因為整個凍干過程中，根據(jù)干燥的不同程度，來確定高室壓、低室壓以及所持續(xù)的時間，保證了水蒸氣由細胞膜的孔隙溢出，即傳質(zhì)速率由細胞膜的固有通導能力決定，保證了細胞內(nèi)外壓差始終很小，減小了對細胞的傷害。

產(chǎn)品的冷凍干燥需要在一定裝置中進行，這個裝置叫做真空冷凍干燥機或冷凍干燥裝置，簡稱凍干機。

凍干機按系統(tǒng)分，由制冷系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、加熱系統(tǒng)和控制系統(tǒng)四個主要部分組成。按結構分，由凍干箱或稱干燥箱、冷凝器或稱水汽凝結器、制冷機、真空泵和閥門、電氣控制元件等組成。

凍干箱是一個能夠制冷到-55℃左右，能夠加熱到+80℃左右的高低溫箱，也是一個能抽成真空的密閉容器。它是凍干機的主要部分，需要凍干的產(chǎn)品就放在箱內(nèi)分層的金屬板層上，對產(chǎn)品進行冷凍，并在真空下加溫，使產(chǎn)品內(nèi)的水分升華而干燥。

冷凝器同樣是一個真空密閉容器，在它的內(nèi)部有一個較大表面積的金屬吸附面，吸附面的溫度能降到-40℃～-70℃以下，并且能維持這個低溫范圍。冷凝器的功用是把凍干箱內(nèi)產(chǎn)品升華出來的水蒸氣凍結吸附在其金屬表面上。

凍干箱、冷凝器、真空管道、閥門、真空泵等構成凍干機的真空系統(tǒng)。真空系統(tǒng)要求沒有漏氣現(xiàn)象，真空泵是真空系統(tǒng)建立真空的重要部件。真空系統(tǒng)對于產(chǎn)品的迅速升華干燥是必不可少的。

制冷系統(tǒng)由制冷機與凍干箱、冷凝器內(nèi)部的管道等組成。制冷機可以是互相獨立的二套或以上，也可以合用一套。制冷機的功用是對凍干箱和冷凝器進行制冷，以產(chǎn)生和維持它們工作時所需要的低溫，它有直接制冷和間接制冷二種方式。

加熱系統(tǒng)對于不同的凍干機有不同的加熱方式。有的是利用直接電加熱法；有的則利用中間介質(zhì)來進行加熱，由一臺泵(或加一臺備用泵)使中間介質(zhì)不斷循環(huán)。加熱系統(tǒng)的作用是對凍干箱內(nèi)的產(chǎn)品進行加熱，以使產(chǎn)品內(nèi)的水分不斷升華，并達到規(guī)定的殘余含水量要求。

控制系統(tǒng)由各種控制開關，指示調(diào)節(jié)儀表及一些自動裝置等組成，它可以較為簡單，也可以很復雜。一般自動化程度較高的凍干機則控制系統(tǒng)較為復雜。控制系統(tǒng)的功用是對凍干機進行手動或自動控制，操縱機器正常運轉(zhuǎn)，以使凍干機生產(chǎn)出合乎要求的產(chǎn)品來。

冷凍干燥的程序：

1、在凍干之前，把需要凍干的產(chǎn)品分裝在合適的容器內(nèi)，一般是玻璃模子瓶、玻璃管子瓶，裝量要均勻，蒸發(fā)表面盡量大而厚度盡量薄一些；

2、然后放入與凍干箱板層尺寸相適應的金屬盤內(nèi)。對瓶裝一般采用脫底盤，有利于熱量的有效傳遞。

3、裝箱之前，先將凍干箱進行空箱降溫，然后將產(chǎn)品放入凍干箱內(nèi)進行預凍；或者將產(chǎn)品放入凍干箱內(nèi)板層上同時進行預凍；

4、抽真空之前要根據(jù)冷凝器制冷機的降溫速度提前使冷凝器工作，抽真空時冷凝器至少應達到-40℃的溫度；

5、待真空度達到一定數(shù)值后（通常應達到13Pa～26Pa內(nèi)的真空度），或者有的凍干工藝要求達到所要求的真空度后繼續(xù)抽真空1～2h以上；即可對箱內(nèi)產(chǎn)品進行加熱。一般加熱分兩步進行，第一步加溫不使產(chǎn)品的溫度超過共熔點或稱共晶點的溫度；待產(chǎn)品內(nèi)水分基本干完后進行第二步加溫，這時可迅速地使產(chǎn)品上升的規(guī)定的最高許可溫度。在最高許可溫度保持2h以上后，即可結束凍干。

整個升華干燥的時間約12～24h左右有的甚至更長，與產(chǎn)品在每瓶內(nèi)的裝量，總裝量，玻璃容器的形狀、規(guī)格，產(chǎn)品的種類，凍干曲線及機器的性能等等有關。

凍干結束后，要充入干燥無菌的空氣進入干燥箱，然后盡快地進行加塞封口，以防重新吸收空氣中的水分。

在凍干過程中，把產(chǎn)品和板層的溫度、冷凝器溫度和真空度對照時間劃成曲線，叫做凍干曲線。一般以溫度為縱坐標，時間為橫坐標。凍干不同的產(chǎn)品采用不同的凍干曲線。同一產(chǎn)品使用不同的凍干曲線時，產(chǎn)品的質(zhì)量也不相同，凍干曲線還與凍干機的性能有關。因此不同的產(chǎn)品，不同的凍干機應用不同的凍干曲線。