過短的PCR產(chǎn)物為什么不適于直接測序？

wangzy0709 2010-11-25 08:07:42 862 瀏覽

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宋澈鐘意勛 2010-11-27 00:00:00

這里有兩個問題，pcr產(chǎn)物測序和pcr過短的問題熟悉pcr產(chǎn)物測序原理就明白，前面20-30個bp測出來市數(shù)據(jù)是不準確的，測序范圍大概是800左右，超過的需要雙向測序。過短的pcr產(chǎn)物，pcr測序肯定需要純化的，如果太短的話，在膠回收的時候很可能影響pcr產(chǎn)物濃度。一般pcr送樣測序的條件A未純化PCR產(chǎn)物的要求，1. 片段大于200bp；2.請?zhí)峁?0ul PCR擴增產(chǎn)物(總量1ug-2ug)；3.取3ul樣品，應該能夠清晰的分辨出目的條帶；自帶引物，引物濃度不低于5uM，并請注明。B純化后PCR產(chǎn)物的要求1.PCR產(chǎn)物溶于蒸餾水中(請勿溶解在TE溶液中)； 2.濃度大于20ng/ul，體積大于10ul，長片段需適當增加量；3.電泳檢測條帶專一；自帶引物價格都不是很貴，一般能22-25元一次。

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潛新兒 2010-11-26 00:00:00

目前用的測序儀一般是基于PCR方法的sanger法原理，那么用你的PCR產(chǎn)物為模板，測序引物從Z兩端開始，么測序時由于測序儀的毛細電泳管分辨率問題，測序引物后的50個左右長度堿基測不出。測序儀通常從測序引物起延伸50個左右bp后，才能分辨，讀出序列。當然，如果你用第三代或第四代測序技術，稱為next generation DNA sequencing 或next next generation DNA sequencing，那么再短的PCR產(chǎn)物也能測出來。這種新的測序方法通常Z長也就是測50到60bp。

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a520131400701 2010-11-29 00:00:00

首先過短的PCR產(chǎn)物純化困難，一般的PCR產(chǎn)物純化試劑盒都要求PCR產(chǎn)物片段大于150bp，過短的 PCR產(chǎn)物純化和準確定量都非常困難。因此我們要求用于測序的PCR產(chǎn)物一般不低于150bp長度。其次，由于測序技術本身的限制，測序反應對環(huán)境的干擾比較敏感，模板太短的PCR測序受外界的干擾更大，很容易造成測序失敗。--------轉自三博遠志網(wǎng)站(測序FAQ)

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