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- kongxinzhu空 2016-10-20 00:00:00
- 質(zhì)粒提取操作步驟 ——QIAGEN(德國(guó)凱杰)質(zhì)粒提取試劑盒 一、細(xì)菌培養(yǎng)物的生長(zhǎng) 1. 從瓊脂平板上挑取一個(gè)單菌落，接種到2-5mL含有適當(dāng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。將液體培養(yǎng)基置于37℃，300rpm的搖床中振蕩8小時(shí)。 2. 用LB培養(yǎng)基以1/500~1/1000的比例稀釋含菌落的培養(yǎng)基。若為了獲得高拷貝質(zhì)粒，用100-200ul含菌落液體培養(yǎng)基接種到100ml LB培養(yǎng)基中；若為了獲得低拷貝質(zhì)粒，用250~500ul含菌落培養(yǎng)基接種到250ml LB培養(yǎng)基中。讓其在37℃，300rpm的搖床中振蕩12-16小時(shí)。 二、細(xì)菌的收獲和裂解 1. 在6000×g，4℃條件下離心15min，收獲細(xì)菌。 2. 加入10ml Buffer P1重懸細(xì)菌。 3. 添加10ml Buffer P2，劇烈晃動(dòng)離心管4-6次使其徹底混勻，室溫放置5min。 4. 加入10ml冰浴的Buffer P3到此溶菌產(chǎn)物中，晃動(dòng)離心管4-6次使其混勻。 5. 將溶菌產(chǎn)物倒入針口密封的過(guò)濾器中，室溫放置10min，不要插入活塞。 6. 打開(kāi)針口的密封蓋，輕輕擠壓活塞將溶菌產(chǎn)物過(guò)濾到一新的50ml離心管中。 7. 添加2.5ml Buffer ER到過(guò)濾的溶菌液中，充分混勻10次后冰上孵育30min。 三、質(zhì)粒DNA的純化 1. 將QIAGEN-tip 500的柱子掛在另一離心管上，加入10ml Buffer QBT，讓管中溶液慢慢滴下排空。 2. 將第7步冰上孵育的溶菌液加入QIAGEN-tip柱子中讓其透過(guò)樹(shù)脂慢慢滴下。 3. 用2×30ml Buffer QC洗QIAGEN-tip柱。 4. 再用15ml Buffer QN洗脫DNA，用離心管收集DNA洗脫液。 5. 加入10.5ml異丙醇到洗脫液中使DNA沉淀下來(lái)，混勻。15000×g，4℃離心30min，離心后小心倒出上清液。 6. 洗DNA用5ml無(wú)內(nèi)毒素-70%乙醇(添加40ml 96%-乙醇到試劑盒的無(wú)內(nèi)毒素水中)，15000×g，4℃離心10min。小心倒出上清液不要碰到質(zhì)粒。 7. 烘干離心管底部的質(zhì)粒5-10min。用500ul無(wú)內(nèi)毒素的Buffer TE重新溶解DNA。
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2011-11-13 10:10:05
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