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- kongxinzhu空 2017-11-24 00:00:00
- 從細菌中分離質粒DNA的方法都包括3個基本步驟：培養(yǎng)細菌使質粒擴增；收集和裂解細胞；分離和純化質粒DNA。采用強堿液、加熱或溶菌酶（主要針對革蘭氏陽性細菌）可以破壞菌體細胞壁，十二烷基磺酸鈉（SDS）和TritonX-100（一般很少使用）可使細胞膜裂解。經溶菌酶和SDS或Triton X-100處理后，細菌染色體DNA會纏繞附著在細胞碎片上，同時由于細菌染色體DNA比質粒大得多，易受機械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當用強熱或酸、堿處理時，細菌的線性染色體DNA變性，而共價閉合環(huán)狀DNA(Covalently closed circularDNA，簡稱cccDNA）的兩條鏈不會相互分開，當外界條件恢復正常時，線狀染色體DNA片段難以復性，而是與變性的蛋白質和細胞碎片纏繞在一起，而質粒DNA雙鏈又恢復原狀，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中。在細菌細胞內，共價閉環(huán)質粒以超螺旋形式存在。在提取質粒過程中，除了超螺旋DNA外，還會產生其它形式的質粒DNA。如果質粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉而消除鏈的張力，形成松弛型的環(huán)狀分子，稱開環(huán)DNA(Open circularDNA，簡稱ocDNA）；如果質粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂，則形成線狀DNA(LinearDNA）。當提取的質粒DNA電泳時，同一質粒DNA其超螺旋形式的泳動速度要比開環(huán)和線狀分子的泳動速度快。
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