質(zhì)譜測定蛋白質(zhì)分子量的原理是什么？

蛋白質(zhì)濃度測定的各種方法及原理是生物化學和分子生物學實驗中的重要環(huán)節(jié)。蛋白質(zhì)濃度的準確測定對于研究生物分子相互作用、蛋白質(zhì)功能和動力學、以及生物樣品的分析和鑒定等方面都具有重要的意義。本文將介紹幾種常用的蛋白質(zhì)濃度測定方法及其原理，包括紫外吸收法、微量凱氏定氮法、雙縮尿法、Lowry 法和考馬斯亮藍法等。通過對這些方法的比較和分析，可以更好地了解它們的優(yōu)缺點，以便根據(jù)實際實驗需求選擇合適的方法來測定蛋白質(zhì)濃度。

①紫外吸收法

檢測原理：

蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共扼雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關系，進行蛋白質(zhì)含量的測定。

方法特點：

優(yōu)點：簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后仍能回收使用。

缺點：測定蛋白質(zhì)含量的準確度較差，干擾物質(zhì)多。

干擾物：含有嘌呤、嘧啶、核酸等吸收紫外光的物質(zhì)。

檢出限：50~100ug蛋白含量。

適用范圍：適于用測定與標準蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。

②微量凱氏定氮法

凱氏定氮法被國內(nèi)外視為蛋白質(zhì)含量的標準檢驗方法，可作為衡量其他蛋白質(zhì)含量檢測方法準確性的標準。

實驗原理：

樣品與濃硫酸共熱，含氮有機物即分解產(chǎn)生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經(jīng)強堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計算得樣品之氮含量。

方法特點：

優(yōu)點：通用性強，測定費用低，易實現(xiàn)，儀器簡單且測定結果的重復性和重現(xiàn)性好。

缺點：實驗耗時長、靈敏度低。

檢出限：0.2~1mg蛋白含量。

適用范圍：凱氏定氮法測的是總蛋白的量，一些非蛋白氮無法檢測出。

③雙縮尿法

實驗原理：

雙縮尿（NH3CONHCONH3）是兩個分子經(jīng)180℃左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。在強堿溶液中，雙縮尿與CuSO4形成紫色絡合物，稱為雙縮尿反應。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鏈，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮尿反應。紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關。

方法特點：

優(yōu)點：適合檢測總蛋白質(zhì)的含量，操作簡單、測量速度快。

缺點：標準物質(zhì)必須使用代表性很強的樣品，需使用其他參考方法測出標準物質(zhì)中的蛋白質(zhì)總含量，故測定工作費力費時。不宜測定樣品種類多、彼此差異大的樣品。

檢出限：測定蛋白質(zhì)含量測定范圍為1-20mg蛋白質(zhì)。

干擾物：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。

適用范圍：常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。

④Lowry 法

Lowry 法是雙縮脲法的發(fā)展，結合了雙縮脲試劑和酚試劑與蛋白質(zhì)的反應，是最靈敏的蛋白質(zhì)測定方法之一，在生物化學領域得到廣泛的應用，目前分為基本法和改良簡易法，改良簡易法可獲得與基本法相近的結果。

基本法實驗原理：

顯色原理與雙縮尿法相同，但加入了Folin-酚酞試劑，以增加顯色量，從而提高檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應產(chǎn)生深蘭色的原因是：①在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結合生成復合物。②Folin一酚試劑中的磷鉬酸鹽一磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。

特點：

優(yōu)點：靈敏度高。

缺點：耗費時間長，操作時間需精-準控制，標準曲線繪制麻煩，專一性較差，干擾物質(zhì)比較多。

檢出限：可檢測的最-低蛋白質(zhì)量達5ug。通常測定范圍是20~250ug。

干擾物：酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等。

適用范圍：除蛋白含量測定，也可用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。

⑤考馬斯亮藍法

實驗原理：

考馬斯亮藍G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結合，使染料的最-大吸收峰的位置（max），由465mm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{色。經(jīng)研究認為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合。在595mm下測定的吸光度值A595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。

方法特點：

優(yōu)點：靈敏度比Lowry高約4倍，高效率、檢測過程簡便、只需要一種試劑，抗干擾能力強。

缺點：測定誤差大，不適用于不同蛋白的檢測。

檢出限：其最-低蛋白質(zhì)檢測量可達1ug。

干擾物：干擾物質(zhì)少，但去污劑、TritonX-100、十二烷基硫酸鈉、0.1N的NaOH會干擾實驗測定。

蛋白質(zhì)含量測定方法選擇

蛋白質(zhì)含量測定時，考慮以下因素后選定適用的檢測方法。

①實驗對測定所要求的靈敏度和精確度；

②蛋白質(zhì)的性質(zhì)；

③溶液中存在的干擾物質(zhì)；

④測定所要花費的時間。

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