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  一只小鳥(niǎo)5711 2016-01-22 00:00:00

  　　蛋白磷酸激酶是能催化磷酸基團(tuán)從磷酸供體轉(zhuǎn)移到受體蛋白的酶，通常ATP的γ位磷酸(或其它三磷酸核苷)為供體。國(guó)際生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)根據(jù)受體氨基酸的特異性，將蛋白激酶分為以下幾類： 　　①以蛋白乙醇基作為受體的磷酸轉(zhuǎn)移酶稱為蛋白絲氨酸或蘇氨酸激酶; 　?、谝员交鶠榱姿崾荏w的磷酸轉(zhuǎn)移酶稱為蛋白酪氨酸激酶; 　?、垡訦is，Arg或Lys為受體的磷酸轉(zhuǎn)移酶稱蛋白His激酶; 　?、芤訡ys殘基作為受體的磷酸轉(zhuǎn)移酶稱蛋白Cys激酶; 　　⑤以乙?；鳛槭荏w的磷酸轉(zhuǎn)移酶稱天冬或谷氨酰胺激酶。 前兩類酶Z常見(jiàn)，許多蛋白絲/蘇氨酸或酪氨酸激酶已被純化。利用分子生物學(xué)技術(shù)，已克隆出100多個(gè)蛋白激酶的基因。有些已通過(guò)測(cè)定其核苷酸序列而推出其相應(yīng)的氨基酸序列。在很多情況下，克隆的酶基因產(chǎn)物氨基酸受體特異性不能被直接測(cè)定，一般是通過(guò)序列分析與已知特異性的蛋白激酶比較而得出。所有已知的絲/蘇和酪氨酸蛋白激酶都有一個(gè)共同的催化結(jié)構(gòu)域(約270個(gè)氨基酸)，通過(guò)催化結(jié)構(gòu)域的序列同源性比較，可將蛋白酪氨酸激酶家族分成若干亞家族。蛋白絲/蘇氨酸激酶家族較酪氨酸激酶家族大。此外，還有許多有關(guān)His，Lys和Arg特異性磷酸化酶活性的報(bào)道，但這些酶未被純化，其分子結(jié)構(gòu)也不清楚。 　　(一)蛋白磷酸激酶的純化 蛋白激酶的純化分微量純化和大量純化兩種，前者通常應(yīng)用在特殊條件下培養(yǎng)的細(xì)胞，后者一般應(yīng)用于特殊的組織器官。微量純化的優(yōu)點(diǎn)是克隆化的細(xì)胞株具有均一的細(xì)胞類型并處于同步的細(xì)胞周期，細(xì)胞內(nèi)成分可被放射性同位素特異標(biāo)記，在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)加特殊因素可研究細(xì)胞內(nèi)某些感興趣的途徑。缺點(diǎn)是原料少，純化出的蛋白量有限。 對(duì)某種新的蛋白激酶的物理特性一般并不清楚 ，因此對(duì)未知蛋白激酶的純化沒(méi)有一個(gè)固定的程序。為了從有限的原材料中純化蛋白激酶，通常采用的策略是： 　?、僭谶M(jìn)行GX的親和純化以前采用傳統(tǒng)的色譜方法去除含量Z多的雜蛋白; 　?、谠诩兓缙谌コ齓Z劑和失活劑; 　?、厶幚眢w積應(yīng)盡快減小并避免透析; 　?、芗兓襟E盡量快并避免冷凍。 　　用于去除大量雜蛋白的傳統(tǒng)色譜技術(shù)包括陽(yáng)離子和陰離子交換、疏水和凝膠排阻色譜。這些技術(shù)在許多有關(guān)蛋白質(zhì)純化的書(shū)籍中都有詳細(xì)介紹，酶純化的理想方案應(yīng)在各步驟間不經(jīng)透析即能進(jìn)行順利過(guò)渡。如離子交換步驟以后進(jìn)行疏水色譜;凝膠排阻色譜放在Z后使蛋白質(zhì)和鹽分子分開(kāi)，但要注意在凝膠排阻介質(zhì)中加入0.2～0.5mol/L鹽以防酶非特異地與介質(zhì)結(jié)合或聚合。檢查酶在離子交換和疏水柱上的結(jié)合和洗脫行為的Z簡(jiǎn)單方法是根據(jù)酶的理化特性將少量介質(zhì)與少部分蛋白激酶在合適的pH下混合，然后變化離子強(qiáng)度后分析上清中酶的活性。完成以上純化步驟后，可以進(jìn)行親和純化(常用的親和配基為三磷酸核苷、底物或效應(yīng)物分子)。通過(guò)GX親和純化手段使蛋白磷酸激酶達(dá)到104～106倍數(shù)的純化，才能使產(chǎn)物達(dá)到均一。 為了自培養(yǎng)細(xì)胞或組織器官中純化蛋白激酶 ，通常選用惰性系統(tǒng)，如Pharmacia的FPLC系統(tǒng)。該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是具有很大的內(nèi)在惰性，并具有保持大分子生物活性的特點(diǎn)。該系統(tǒng)在一個(gè)單元內(nèi)含有單一的硬件，可在冷室和室溫操作。此外，可采用快速的梯度(40～45分鐘)形式和較廣適用范圍的GX凝膠和柱系統(tǒng)。這是因?yàn)樵诖藯l件下多數(shù)蛋白質(zhì)不與樹(shù)脂結(jié)合，包括能使激酶失活的磷酸酶。然而，許多激酶盡管其表現(xiàn)等電點(diǎn)≤5.5，但在中性條件下仍可與MonoS結(jié)合，這可能是由于其磺酸基與ATP或底物分子結(jié)構(gòu)有些類似。大體積抽提物可用泵直接進(jìn)樣，并進(jìn)行連續(xù)兩次的離子交換分離。FPLC預(yù)裝的凝膠排阻柱可在30分鐘內(nèi)完成分離，較傳統(tǒng)凝膠快得多。但由于柱填料粒度小，上樣體積不超過(guò)200μl，樣品量不超過(guò)5～10mg，純化量較小有些性質(zhì)難以鑒定，因而需多次純化。Pharmacia引入一種新的介質(zhì)(Sephacryl HR)較傳統(tǒng)的超細(xì)膠流速快5倍，這些凝膠在很大程度上減小了凝膠過(guò)濾色譜的時(shí)間。在完成親和純化后，酶的純度可用SDS-PAGE檢測(cè)并定量測(cè)定其比活性。 　　(二)蛋白磷酸激酶的活性分析　 　　蛋白激酶活性分析分為兩步： 　?、倌┒藰?biāo)記的三磷酸核苷核供體(通常是ATP，有時(shí)用GTP)中的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)或肽底物上; 　?、趯⒘姿峄牡孜锓蛛x出并進(jìn)行定量分析。 　　前者通常在溶液中進(jìn)行，酶和底物均在液相中。后者為了去除游離的標(biāo)記核苷酸，通常需要用三氯醋酸沉淀、SDS-PAGE分離或使標(biāo)記底物結(jié)合于纖維素膜上。 　　有時(shí)可將酶或底物固定于固相載體上，如蛋白質(zhì)混合物經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后封閉，放入含有酶和標(biāo)記ATP的溶液中?；蛘吒M(jìn)一步，設(shè)計(jì)一個(gè)蛋白激酶分析系統(tǒng)(酶活性的原位分析)，將蛋白激酶和它的底物均固定于硝酸纖維素膜上，這一方法可與標(biāo)準(zhǔn)的液相分析方法達(dá)到相等的靈敏度和線性范圍。其分析原理是含有蛋白激酶活性的樣品先固定于硝酸纖維素膜上(點(diǎn)滴或真空抽吸)，然后將濾膜浸入合適的蛋白底物溶液中，底物蛋白質(zhì)與剩余的膜結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，然后加入同位素標(biāo)記的ATP，作用一定時(shí)間后洗去膜上未反應(yīng)的ATP并終止反應(yīng)，參入物經(jīng)放射自顯影或液閃計(jì)數(shù)定量，與膜結(jié)合的酶和底物均具有一定的運(yùn)動(dòng)性，兩者反應(yīng)的定量值代表磷酸化的程度。 　　以酪蛋白激酶Ⅱ的活性測(cè)定方法為例： 　　試劑：緩沖液A25mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，100mmol/LNaCl，pH8.0 　　緩沖液B25mmol/L Tris，1mmol/LEDTA，200mmol/L NaCl，10%甘油 　　(V/V)，1mmol/L DTT，pH8.0 　　酪蛋白激酶Ⅱ底物　水解或部分脫磷酸的酪蛋白10mg/ml溶解于緩沖液A中。 　　酪蛋白激酶Ⅱ反應(yīng)混合物　25mmol/L Tris，pH8.5，100mmol/L NaCl，10mmol/LMgCl2，1mmol/L DTT，0.1μmol/L〔V-32P〕ATP(100Ci/mmol) 　　操作步驟： 1.剪一適當(dāng)大小的硝酸纖維素膜并劃成25px大小的方格; 　　2.用緩沖液A浸濕膜并放于一用同樣緩沖液浸濕的濾紙上，使膜平坦; 　　3.用緩沖液B(含1mg/ml牛血清白蛋白)將樣品稀釋到合適的濃度，膜上每個(gè)點(diǎn)所加的樣品其激酶活性在0.5～50pmol單位(1pmol單位代表每分鐘轉(zhuǎn)移1pmol 32P的酶量)，當(dāng)酶比活性在1μmol/min·mg-1時(shí)則每個(gè)點(diǎn)應(yīng)加純酶0.5～50ng; 用微量加樣器加1～5μl樣品于膜上方格ZY ，待液滴消失后將膜面對(duì)含有緩沖液A(包括1～10mg/ml的底物)的Parafilm封口膜(貼于玻璃平板上)，在濕潤(rùn)環(huán)境中23℃作用30分鐘。大片膜可密封于塑料袋中; 　　5.在100ml緩沖液A中洗膜并置于一新的Parafilm膜上(加有反應(yīng)混合物溶液25 　　μl/cm2)，23℃作用5～30分鐘; 　　6.用緩沖液A 100ml洗膜4次，空氣干燥后進(jìn)行放射自顯影?；蚯谐煞綁K進(jìn)行液閃計(jì)數(shù)定量。 該方法在應(yīng)用時(shí)Z常見(jiàn)的問(wèn)題是硝酸纖維素膜過(guò)載(指總蛋白或酶活力單位)。硝酸纖維素膜結(jié)合BSA的線性范圍可達(dá)50μg/cm2(相當(dāng)于每斑點(diǎn)5μg)，而結(jié)合容量可達(dá)500μg/cm2，如果樣品本身造成蛋白質(zhì)超載，則應(yīng)降低稀釋液中的BSA濃度。同時(shí)應(yīng)注意不要加過(guò)量的酶，因?yàn)槌^(guò)50pM單位即超過(guò)了該方法的線性范圍，并可能影響硝酸纖維素膜鄰近斑點(diǎn)的檢測(cè)。該方法用于其它蛋白激酶檢測(cè)時(shí)應(yīng)適當(dāng)變換測(cè)定條件。因蛋白激酶活性的斑點(diǎn)印跡方法與標(biāo)準(zhǔn)的液相方法在靈敏度、檢測(cè)范圍、線性等方面相當(dāng)，所以可以代替后者進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)。也在天然凝膠電泳和轉(zhuǎn)移電泳后分析蛋白激酶活性的分布，可用于分析酶在不同發(fā)育階段各組織表達(dá)的變化、cDNA克隆分析和突變體分析。

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