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  13674586743 2008-12-26 00:00:00

  現(xiàn)在流行的宏基因組學(xué)中一部分就是搞這個不可培養(yǎng)的微生物的。

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  博學(xué)女生 2016-03-11 00:00:00

  稀釋培養(yǎng)法和高通量培養(yǎng)法 d.pp3D 9/ 在地球環(huán)境中，海洋環(huán)境中迄今可培養(yǎng)微生物的比例Z低，僅為0.001% ～ 0.1%，這是由于海洋環(huán)境中主要是寡營養(yǎng)微生物，它們在人工培養(yǎng)時往往受到少數(shù)優(yōu)勢生長的微生物的競爭作用而不能生長。為了克服該缺陷，1993 年Button從概率論的角度提出一個嶄新的方法，即稀釋培養(yǎng)法（Dilution culture）。該方法認(rèn)為，當(dāng)把海水中微生物群體稀釋至痕量時，在海水中主要存在的寡營養(yǎng)微生物可以不受少數(shù)幾種優(yōu)勢微生物的競爭作用的干擾，因而主體寡營養(yǎng)微生物被培養(yǎng)的可能性會大大提高。隨后，Schut等的實際操作驗證了該理論的正確性。 ';/84j-3F 2002 年Connon在稀釋培養(yǎng)法的基礎(chǔ)上提出高通量培養(yǎng)法（High-throughput culturing，HTC）。將樣品稀釋至痕量后，采用小體積48 孔細(xì)胞培養(yǎng)板分離培養(yǎng)微生物。該方法不僅有效提高微生物的可培養(yǎng)性，還可在短期內(nèi)監(jiān)測大量的培養(yǎng)物，大大提高工作效率。Cho等利用該方法從太平洋近海和遠(yuǎn)洋海水中也分離出多種新菌。Rappé 和Connon結(jié)合熒光原位雜交技術(shù)（FISH），對高通量培養(yǎng)法進行了改進，根據(jù)從培養(yǎng)板各孔中針對性地檢測SAR11 進化分支的海洋細(xì)菌的存在，在較短時間內(nèi)對目標(biāo)微生物進行了大量的培養(yǎng)。但是，稀釋培養(yǎng)法和高通量培養(yǎng)法成功的原因恰恰又是制約其進一步發(fā)展的障礙。在樣品稀釋、微生物間的不利作用被削弱的同時，有利作用也被削弱。例如，當(dāng)微生物被極度稀釋、初始接種量很小時，一些微生物分泌的代謝產(chǎn)物也被稀釋，其他關(guān)聯(lián)微生物細(xì)胞由于缺乏這些必須的代謝產(chǎn)物，生長就會受到Y(jié)Z；另外，缺少種間的共生關(guān)系和群體效應(yīng)，很多微生物仍然不可培養(yǎng)。 O3!d(dY=_ tF`MT%{Va 3.2 擴散盒培養(yǎng)法 GOW"o"S Kaeberlein〔2〕等在分離培養(yǎng)潮間帶底泥中的微生物時使用一種新穎的自制培養(yǎng)儀器，為其起名為擴散盒（Diffusiongrowth chamber）。擴散盒由一個環(huán)狀的不銹鋼墊圈和兩側(cè)膠連的0.1μm 濾膜組成，濾膜只能允許培養(yǎng)環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)通過而不能讓細(xì)胞通過。將底泥樣品置于擴散盒內(nèi)的半固體培養(yǎng)基中，擴散盒置于魚缸底部的天然海洋底泥上，往魚缸內(nèi)加入天然海水并保證擴散盒內(nèi)存有一定空氣供微生物生長。培養(yǎng)時，使天然海水循環(huán)流動，并不斷注入新鮮的海水。培養(yǎng)1 周后培養(yǎng)基上產(chǎn)生大量的微型菌落，數(shù)目高達(dá)接種微生物的40%。這種培養(yǎng)方法能較大程度地模擬微生物所處的自然環(huán)境，由于化學(xué)物質(zhì)可以自由穿過薄膜，可保證微生物群落間作用的存在，提高微生物可培養(yǎng)性。擴散盒法的主要不足是操作比較繁瑣。 b%nkIPA y~p4">] 3.3 細(xì)胞包囊法 hNO )~rt Zengler 等將海水和土壤樣品中的微生物先進行類似稀釋培養(yǎng)法的稀釋過程，然后乳化，部分微生物形成了僅含單個細(xì)胞的膠狀微滴。然后將膠狀微滴裝入層析柱內(nèi)，使培養(yǎng)液連續(xù)通過層析柱進行流態(tài)培養(yǎng)。層析柱進口端用0.1μm 濾膜封住，防止細(xì)菌的進入而污染層析柱；出口端用8μm 濾膜封住，允許培養(yǎng)產(chǎn)生的細(xì)胞隨培養(yǎng)液流出。該方法的特點是讓微生物在開放式培養(yǎng)液中生長，使培養(yǎng)環(huán)境接近于微生物的自然生長環(huán)境，能夠很好地提高微生物可培養(yǎng)性，但成本較高，不利于普及使用。 & zgPN8u a Qmfrx 3.4 序列引導(dǎo)分離技術(shù) _:5=| 2-E 序列引導(dǎo)分離技術(shù)（Sequence-guiding isolation）是根據(jù)微生物基因組中特定基因的特異性序列，設(shè)計引物或雜交探針，以培養(yǎng)物中目標(biāo)序列存在和變化情況為標(biāo)準(zhǔn)，來指導(dǎo)對微生物Z優(yōu)培養(yǎng)條件的選擇，培養(yǎng)出新的微生物。Stevenson在細(xì)菌培養(yǎng)過程中采用了多種培養(yǎng)條件的組合，導(dǎo)致培養(yǎng)方案繁多復(fù)雜。為了減少分離細(xì)菌的工作量、節(jié)省時間，用PCR 作為監(jiān)測手段來確定目標(biāo)細(xì)菌是否得到培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上長出菌落后，用緩沖液沖洗培養(yǎng)基表面，提取沖洗液中細(xì)菌的DNA，根據(jù)目標(biāo)細(xì)菌的16S rDNA擴增情況判斷目標(biāo)細(xì)菌的存在與否。繼續(xù)用PCR方法監(jiān)測目標(biāo)細(xì)菌直至分離得到純菌株。Béjà 等通過對尚未培養(yǎng)的海洋變形細(xì)菌的BAC 基因文庫進行研究，發(fā)現(xiàn)該類菌具有編碼視紫紅質(zhì)的基因片段。視紫紅質(zhì)是光營養(yǎng)過程中不可或缺的化學(xué)物質(zhì)。據(jù)此設(shè)想增加光照可提高該菌的可培養(yǎng)性，而進一步的實驗結(jié)果驗證了該假設(shè)的正確性。此外，Breznak指出，分子原位雜交技術(shù)可以對推斷目標(biāo)微生物的代謝方式和營養(yǎng)需求提供幫助，極大地節(jié)省工作時間，操作也很簡便，僅需要一種特異性的探針，顯示了在微生物培養(yǎng)時引入分子生物學(xué)技術(shù)作為引導(dǎo)的優(yōu)勢和力量。

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